MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ Přírodovědecká fakulta Biochemie VÝZKUMNÝ ÚSTAV VETERINÁRNÍHO LÉKAŘSTVÍ, V.V.I. Mgr. Radek Tesařík Purifikace a analýza mikrobiálních proteinů pomocí chromatografických a elektroforetických metod Disertační práce Školitel: RNDr. Jaroslav Turánek, CSc. Brno 2007 Bibliografická identifikace Jméno a příjmení autora: Mgr. Radek Tesařík Název disertační práce: Purifikace a analýza mikrobiálních proteinů pomocí chromatografických a elektroforetických metod Název disertační práce anglicky: Purification and analysis of microbial proteins using chromatographic and electrophoretic methods Studijní program: Biochemie Studijní obor (směr), kombinace oborů: Biochemie Školitel: RNDr. Jaroslav Turánek, CSc. Rok obhajoby: 2007 Klíčová slova v češtině: exprese, bakulovirus, PRRSV, nukleokapsidový protein N, SDS-PAGE, imunoblot, purifikace preparativní elektro-eluční SDS-PAGE, ELISA, Paracoccus denitrificans, kapalinová chromatografie, pseudoazurin, Fe(III) reduktáza, MALDI-TOF, síťování, dynamický a statický rozptyl světla, Trichofyton verrucosum, trichofytóza, hyfový a sporový antigen Klíčová slova v angličtině: expression, baculovirus, PRRSV, nucleocapsid protein N, SDS-PAGE, immunoblot, purification, preparative electroelution SDS-PAGE, ELISA, Paracoccus denitrificans, liquid chromatography, pseudoazurin, Fe(III) reductase, MALDI-TOF, Cross-linking, dynamic and static light scattering, Trichofyton verrucosum, Trichophytosis, hyphal and spore antigens Radek Tesařík, Masarykova univerzita v Brně, 2007 PODĚKOVÁNÍ Touto cestou chci poděkovat svému školiteli RNDr. Jaroslavu Turánkovi, CSc. za odborné vedení, cenné rady, připomínky a všestrannou pomoc při realizaci a zpracování této práce. Dále bych chtěl poděkovat MVDr. Ivanu Pšikalovi, CSc. a Mgr. Evě Kosinové, Ph.D. za pomoc a rady v oblasti molekulární virologie při přípravě rekombinantních klonů a MVDr. Ladislavu Rodákovi, DrSc. a MVDr. Kamilu Kovařčíkovi, Ph.D. za pomoc při sestavování ELISA metody. Velice rád bych poděkoval prof. RNDr. Igoru Kučerovi, DrSc., RNDr. Zbyňku Zdráhalovi, Dr., Mgr. Marku Koutnému, Ph.D., Mgr. Jiřímu Mazochovi, Ph.D., Mgr.Vojtěchu Sedláčkovi a Mgr. Ondreji Šedovi, Ph.D. za spolupráci, cenné rady a metodickou pomoc při řešení problematiky spojené s bakterií Paracoccus denitrificans. Mé díky patří i dalším pracovníkům a kolegům z oddělení vakcinologie a imunoterapie, imunologie a virologie Výzkumného ústavu veterinárního lékařství, v.v.i., kteří mi vždy ochotně pomohli, a to zejména RNDr. Janě Plockové, Mgr. Lubomíru Procházkovi, MVDr. Martinu Faldynovi, Ph.D. a Mgr.Barboře Pavlové. Poděkování patří rovněž MVDr. Josefu Krejčímu za pomoc při korektuře a RNDr. Olze Matouškové, Ing. Vladimíru Grofovi a Andree Ďurišové za grafickou úpravu disertační práce. V neposlední řadě děkuji své rodině a všem svým blízkým za lásku, podporu a pochopení. Tato práce vznikla za finanční podpory projektu (MZE 0002716201) Ministerstva zemědělství České republiky. Abstrakt Nukleokapsidové proteiny N evropského a severoamerického sérotypu viru reprodukčního a respiračního syndromu prasat (PRRSV) byly připraveny v eukaryotním bakulovirovém systému genové exprese. Produkce a identita obou rekombinantních nukleokapsidových N proteinů byly prokázány pomocí SDS-PAGE. Specifita rekombinantních proteinů v rekombinantních bakulovirech byla ověřena imunoblotem pomocí anti PRRS prasečího séra a monoklonální protilátky proti viru PRRS. Exprimované proteiny N obou sérotypů byly izolovány z lyzátu hmyzích buněk pomocí preparativní elektro-eluční SDS-PAGE na zařízení Prep Cell Model 491 (Bio-Rad) ve spojení se systémem FPLC (Pharmacia). Koncentrace purifikovaných proteinů N v získaných frakcích, které byly následně analyzovány pomocí SDS-PAGE a imunoblotu, dosahovala hodnot v rozmezí 80 - 250 g/ml. Celkový výtěžek dosahoval 1 mg během jednoho běhu purifikace při zachování čistoty přes 95%. Frakce obsahující čistý nukleokapsidový protein N byly sloučeny a použity jako antigeny k sestavení diagnostického nepřímého ELISA testu k průkazu PRRSV protilátek v sérech prasat. Porovnáním tohoto ELISA testu se standardní diagnostickou soupravou IDEXX HerdCheck ELISA na souboru 552 sér prasat byla stanovena citlivost 98.3 % a specifita 92.6 %. Z anaerobně kultivovaného kmene Pd2121 bakterie Paracoccus denitrificans defektního v cytochromu c550 byl purifikován kombinací iontoměničové a gelové permeační chromatografie periplasmatický protein schopný přenášet elektrony z cytoplasmatické membrány na periplasmatickou nitritreduktázu. Pomocí SDS-PAGE byla potvrzena čistota izolovaného proteinu a stanovena molekulová hmotnost 14 kDa. Použitím analytické gelové permeační chromatografie byla zjištěna stejná velikost a zároveň prokázán výskyt tohoto přenašeče v nativním stavu jako monomeru. Několika dalšími nezávislými charakteristikami (obsah mědi, spektrum ve viditelné oblasti, N-terminální aminokyselinová sekvence) bylo dokázáno, že purifikovaným proteinem je pseudoazurin. Dva rozpustné cytoplasmatické enzymy (FerA a FerB) bakterie Paracoccus denitrificans s Fe(III) reduktázovou aktivitou byly purifikovány kombinací aniontoměničové chromatografie (Sepharose Q), chromatofokusace (Mono P) a gelové permeační chromatografie (Superose 12). Tyto dva enzymy byly dále charakterizovány celou řadou biochemických metod. Byly stanoveny molekulová hmotnost, v případě jednoho z nich potvrzena oligomerní struktura, isoelektrický bod, koenzymové složení, N-terminální aminokyselinové sekvence, substrátové specifity a byly provedeny kinetické studie. FerA je monomer o molekulové hmotnosti 19 kDa, zatímco nativní FerB vykazuje velikost okolo 50 kDa a je tvořen ze dvou stejných podjednotek o velikosti 20 kDa. FerA může být klasifikován jako NADH:flavin oxidoreduktáza se sekvenčním reakčním mechanismem a vyžaduje pro svoji Fe(III) reduktázovou aktivitu přítomnost flavinu jako disociabilního kosubstrátu. Purifikovaný FerB obsahuje nekovalentně vázaný redoxně aktivní koenzym FAD a může využít NADPH místo NADH, neredukuje volný flavin a vykazuje ping-pongový kinetický model se substráty NADH a Fe(III)-NTA. Byly určeny N-koncové aminokyselinové sekvence FerA a FerB. V případě FerB jsme zjistili vysokou podobnost s chromanreduktázou Pseudomonas putida, která byla potvrzena schopností redukovat chroman za přítomnosti NADH. N-koncová sekvence enzymu FerA nejeví významnou podobnost s žádnou známou oxidoreduktázou. Byla provedena proteinová analýza hyfového a sporového antigenu patogenní houby Trichofyton verrucosum pomocí SDS-PAGE. Imunoblotem byla charakterizována molekulová hmotnost proteinů, které jsou zodpovědné za jejich specifickou imunitní reakci. Oba antigeny AgH a AgS vykazovaly stejné dominantní proteiny, nicméně ale drobné rozdíly v jejich proteinovém spektru mohou být příčinou relativně významných odlišností v imunitních reakcích a to jak humorálních, tak i buněčných. Abstract The nucleocapsid proteins N of European and North American serotypes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) were constructed in the eukaryotic baculovirus system of gene expression. Production and identity of both nucleocapsid proteins N were proven using SDS-PAGE. Specificity of recombinant proteins in recombinant baculoviruses was tested by immunoblot technique using anti-PRRS serum from swine and monoclonal antibodies against PRRS virus. The expressed proteins N of both serotypes were isolated from the insect cell lysate by the preparative SDS-PAGE and electroelution using the Prep Cell Model 491 (Bio-Rad) apparatus connected to the system FPLC (Pharmacia). Concentrations of purified proteins N in the obtained fraction, which were subsequently detected by means of SDS-PAGE and immunoblot analysis, ranged between 80 - 250 g/ml. The total yield for one purification run reached 1 mg with purity being more than 95%. Fractions containing pure nucleocapsid protein N were combined and used as antigens for production of an indirect ELISA test for detection of anti-PRRSV antibodies in serum from pigs. This ELISA test was compared with a standard diagnostic kit IDEXX HerdCheck ELISA using a group of sera from 552 pigs; sensitivity and specificity were found to be 98.3 % and 92.6 %, respectively. Periplasmic protein able to transfer electrons from cytoplasmic membrane to the periplasmic nitrite reductase has been purified from the anoxically grown cytochrome c550 ­ deficient strain Pd2121 of bacteria Paracoccus denitrificans by combination of ion-exchange and gel permeation chromatography. Purity of the isolated protein was confirmed by means of SDS-PAGE and molecular mass was shown to be 14 kDa. The same size was detected by analytical gel permeation chromatography. It was found that this transmitter is monomer in native state. The purified protein was shown to be pseudoazurin by several independent criteria (copper content, visible spectrum, N-terminal amino acid sequence). Two soluble cytoplasmic enzymes (FerA and FerB) from bacterium Paracoccus denitrificans with Fe(III) reductase activity were purified by combination of anion-exchange chromatography (Sepharose Q), chromatofocusing (Mono P) and gel permeation chromatography (Superose 12). These two enzymes were further characterised by a number of biochemical methods. Molecular mass (quaternary structure was confirmed in one of them), isoelectrical point, content of coenzymes, N-terminal amino acid sequence and substrate specificity were assessed and kinetic studies were performed. FerA is a monomer with molecular mass of 19 kDa, whereas native FerB exhibits molecular mass of about 50 kDa and consists of two identical subunits of about 20 kDa. FerA can be classified as NADH:flavin oxidoreductase with a sequential reaction mechanism. It requires presence of flavine as dissociable co-substrate for reductase activity on Fe(III). The purified FerB contains a noncovalently bound redox-active FAD coenzyme and it can utilise NADPH instead of NADH, does not act to reduce free flavine and gives a ping-pong type of kinetic pattern with substrates NADH and Fe(III)-NTA. N-terminal amino acid sequences FerA and FerB were detected. In the case of FerB, we found high similarity with chromate reductase from Pseudomonas putida, which was confirmed by the ability to mediate chromate reduction in the presence of NADH. The N-terminal sequence of enzyme FerA did not bear a significant homology to any known oxidoreductase. Protein analysis of antigens containing hyphae and spores in pathogenic fungus Trichofyton verrucosum was performed by means of SDS-PAGE. Molecular mass of proteins was characterised by immunoblot analysis; these proteins are responsible for the specific immune response. The response of the same dominant proteins was observed for both antigens AgH and AgS; nevertheless small dissimilarities in their protein spectra could cause quite important differences in both humoral and cell-mediated immune responses. OBSAH 1. Úvod ............................................................................................................. 11 1.1 Chromatografické a elektromigrační separační metody..................................... 11 1.2 Struktura disertační práce ..................................................................................... 15 2. Preparativní SDS-PAGE: Purifikace nukleokapsidového proteinu N viru reprodukčního a respiračního syndromu prasat (PRRSV) exprimovaného prostřednictvím bakulovirového vektoru v hmyzích buňkách....................................................................... 17 2.1 Úvod.......................................................................................................................... 17 2.1.1 Bakuloviry a jejich expresní systém................................................................. 17 2.1.2 Historie bakulovirů ........................................................................................... 17 2.1.3 Klasifikace........................................................................................................ 18 2.1.4 Struktura a genom viru ..................................................................................... 19 2.1.5 Příprava rekombinantního bakuloviru Bac-N-Blue DNA................................ 21 2.2 Virus reprodukčního a respiračního syndromu prasat....................................... 22 2.2.1 Úvod a historie.................................................................................................. 22 2.2.2 Virus reprodukčního a respiračního syndromu prasat (PRRSV)...................... 22 2.2.3 Přenos a diagnostika PRRSV ........................................................................... 24 2.3 Preparativní SDS-PAGE (Model 491 Prep Cell).................................................. 25 2.4 Nepřímá ELISA....................................................................................................... 25 2.5 Cíl práce................................................................................................................... 26 2.6 Souhrn výsledků...................................................................................................... 27 2.7 Diskuse ..................................................................................................................... 33 3. Purifikace a částečná charakterizace proteinu schopného přenášet elektrony z cytoplasmatické membrány na periplasmatickou nitritreduktázu v periplasmě mutantního kmene bakterie Paracoccus denitrificans postrádajícího cytochrom c550 pomocí kapalinové chromatografie a SDS-PAGE. ............................................... 37 3.1 Úvod - Denitrifikace, denitrifikační enzymy a přenašeče elektronů bakterie Paracoccus denitrificans......................................................................... 37 3.2 Cíl práce................................................................................................................... 39 3.3 Souhrn výsledků...................................................................................................... 39 3.4 Diskuse ..................................................................................................................... 41 4. Purifikace a biochemická charakterizace dvou rozpustných Fe(III) reduktáz bakterie Paracoccus denitrificans................................. 43 4.1 Bakteriální cytoplasmatické ferrikomplex reduktázy......................................... 43 4.1.1 Výskyt ferrikomplex reduktáz.......................................................................... 43 4.1.2 Vlastnosti cytoplasmatických Fe(III)-komplex reduktáz ................................. 43 4.1.3 Funkce cytoplasmatických Fe(III)-komplex reduktáz...................................... 45 4.2 Měření velikosti....................................................................................................... 46 4.2.1 Měření velikosti částic pomocí dynamického rozptylu světla (DLS) a molekulové hmotnosti pomocí statického rozptylu světla (SLS) .................. 46 4.2.2 Měření molekulové hmotnosti pomocí hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF .................................................................................................... 48 4.2.3 Síťování pomocí 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (EDC) s N-hydroxysulfosukcinimidem (sulfo-NHS)....................................... 48 4.3 Cíl práce................................................................................................................... 50 4.4 Souhrn výsledků...................................................................................................... 50 4.4.1 Purifikace a biochemická charakterizace Fe(III)-komplex reduktáz bakterie Paracoccus denitrificans .................................................................... 50 4.4.2 Stanovení velikosti FerA a FerB ...................................................................... 54 4.4.3 Další charakterizace FerA a FerB..................................................................... 62 4.5 Diskuse ..................................................................................................................... 65 5. Analýza proteinů hyfového a sporového antigenu kožní houby Trichophyton verrucosum. .......................................................................... 68 5.1. Úvod.......................................................................................................................... 68 5.2 Trichofytóza............................................................................................................. 68 5.2.1 Trichophyton verrucosum................................................................................. 68 5.2.2 Patogeneze........................................................................................................ 69 5.3 Cíl práce................................................................................................................... 69 5.4 Souhrn výsledků...................................................................................................... 69 5.4.1 Příprava a charakterizace antigenů AgS a AgH ............................................... 69 5.4.2 Stanovení koncentrace bílkovin ve vzorku....................................................... 70 5.4.3 Analýza proteinové složky pomocí SDS-PAGE .............................................. 70 5.4.4 Zjištění velikostí proteinů zodpovědných za specifickou imunitní reakci pomocí imunoblotu................................................................................ 71 5.5 Diskuse ..................................................................................................................... 72 6. Závěry .......................................................................................................... 74 7. Seznam použitých zkratek ......................................................................... 77 8. Seznam použité literatury .......................................................................... 81 9. Prezentované výsledky ............................................................................... 90 10. Seznam publikovaných prací..................................................................... 92 11. Aplikované výstupy..................................................................................... 92 12. Ocenění......................................................................................................... 92 13. Přílohy.......................................................................................................... 94 1. Úvod 1.1 Chromatografické a elektromigrační separační metody Moderní separační metody v současné době slouží nejen k účelům preparativním, ale i analytickým. Mezi nejrozšířenější a nejužívanější patří metody chromatografické a elektromigrační. Na rozdíl od klasických separačních technik, založených většinou na fázových separacích, frakcionace látek při chromatografii a elektroforéze je dána odlišnou pohyblivostí jednotlivých složek směsi za daných podmínek. Tyto metody umožňují velice efektivním způsobem sledovat a stanovovat látky i ve velmi složitých směsích, což by jinými metodami bylo obtížně proveditelné. Používání chromatografie a elektroforézy dalo podnět k rozvoji dalších oborů. Urychlily nebývalou měrou zásadní výzkum v biochemii a medicíně, otevřely nové oblasti biologie a umožnily přivést organickou syntézu včetně makromolekulární na kvalitativně nové základy. Základy chromatografie položil počátkem 20. století ruský botanik M.S.Cvet, který jako první rozdělil na sloupci CaCO3 listová barviva. Cvet zavedl i název chromatografie, z řeckých slov (barva) a (psáti). Téměř o půl století později se objevily zásadní práce zabývající se papírovou a v padesátých letech i plynovou chromatografii. Úsilí věnované této problematice bylo v padesátých létech dokonce oceněno Nobelovou cenou. V roce 1952 ji obdrželi Martin a Synge za zásadní přínos v tomto oboru. Ukázali, že separační rychlost je limitována rychlostí difúze rozpuštěné látky z kapalné do pevné fáze. Zavedli separaci malých molekul, zejména aminokyselin (Martin and Synge, 1941) a v polovině 60. let začali používat média na bázi celulosy (iontoměniče) (Sober and Peterson, 1958). Porath a Flodin poprvé použili média na bázi dextranu pro gelovou filtraci (Porath and Plodin, 1959). V období 1960-69 Hjerten popsal použití separačních médií na bázi agarosy (Hjerten, 1963). V průběhu posledních dvou až tří desetiletí doznala značného rozvoje kapalinová chromatografie. Byly vyvinuty nové vysoce efektivní chromatografické materiály umožňující chromatografickou separaci za vysokého tlaku. Byly vyvinuty nové typy mikropartikulárních nosičů na bázi silikagelu a organických polymerů, které umožnily vznik typu chromatografie, který se označuje HPLC (high performance liquid chromatography)-vysokoúčinná kapalinová chromatografie (Regnier, 1983). Vývoj vysoce porézních mikropartikulárních chromatografických sorbentů s dostatečnou mechanickou pevností umožnil vývoj kolon a zařízení pro rychlou a vysoce účinnou separaci biopolymerů, zejména proteinů. První HPLC systém pro 11 práci ve vodných mobilních fázích s vysokým podílem solí a organických rozpouštědel (Richey, 1982) byl uveden na trh v roce 1982 pod obchodním názvem FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) společností Pharmacia LKB (Uppsala, Sweden). FPLC systém poskytuje plnou škálu chromatografických kolon pro všechny typy separací, jako třeba iontoměniče, chromatofokusaci (Fagerstam et al., 1983), gelovou filtraci, hydrofóbní interakce (Fagerstam and Pettersson, 1979) a v neposlední řadě chromatografii na reversní fázi (Jeppson et al., 1984) a afinitní chromatografii. V roce 1990 byla patentována technika perfúzní chromatografie, která umožňuje dosáhnout separace s vysokým rozlišením již během jedné minuty. Ačkoliv bylo doposud publikováno tisíce prací týkající se použití FPLC, mezi nejvíce populární a používané druhy FPLC patří ionexová a gelová chromatografie, proto jsem je využil k separaci i analýze proteinů v pracích, které jsou předmětem předkládané disertační práce. Elektroforéza je metoda, která využívá schopnosti pohybu nabitých částic v elektrickém poli. Vzhledem k tomu, že rychlost pohybu částic je závislá na velikosti náboje a velikosti molekuly, různě velké a různě nabité molekuly se budou pohybovat odlišnou rychlostí. Můžeme proto elektroforézu využívat k separaci látek a to jak pro analytické účely, tak i pro účely preparativní. Termín ,,elektroforéza" pochází z řečtiny a obecně znamená transport pomocí elektřiny. Přestože je základní princip elektroforézy znám již od konce 19. století, za otce této metody je považován švédský elektrochemik a nositel Nobelovy ceny Arne Tiselius, který roku 1937 vyvinul tzv. metodu pohyblivého rozhraní (Tiselius, 1937a,b). Šlo o elektroforézu v kapalném médiu a k detekci jednotlivých proteinových frakcí byla využívána absorpce světla. Aby se odstranily nedostatky volné elektroforézy, tj. vznik konvenčních proudů a difúze, začala se od konce 40. let 20. století provádět elektroforéza na nosičích, nazývaná též zónová elektroforéza, která poskytovala na rozdíl od kapalinové elektroforézy diskrétní zóny. Mezi další výhody patřilo použití mnohem menšího množství vzorku (asi 100x méně). Prvními použitými nosiči byly filtrační a chromatografický papír, acetát celulosy, škrob (nezgelovatělý) a celulosa (Pauling and Itano, 1949; Smithies, 1955). Díky této metodě se podařilo například separovat abnormální protein srpkovité anemie. Později se jako nosiče začaly používat hlavně gely, a to zejména agarosový a škrobový gel a pravděpodobně nejčastěji a v současnosti nejoblíbenější gel polyakrylamidový, který je inertní, mechanicky pevný, průhledný a nabízí možnost přípravy nosiče různých předem určených vlastností (hustota zesíťování gelu, gradient hustoty gelu). Elektroforéza na polyakrylamidovém gelu (PAGE) se velice 12 hojně využívá především v analýze bílkovin, a to ke zjištění homogenity preparátu v různých stupních isolačního postupu a k částečné fyzikálně-chemické charakterizaci bílkoviny. První elektroforézu na polyakrylamidovém gelu (PAGE) vyvinuli v roce 1964 Ornstein a Davis, která se vyznačovala vysokou rozlišitelností nativních proteinů (Ornstein, 1964; Davis, 1964). Používali diskontinuální pufrovací systém včetně zaostřovacího gelu s velkými póry a hustšího gelu na rozdělení proteinů. Tento systém byl zdokonalován v dalších pracích až nakonec vyústil v dnešní velmi oblíbenou elektroforézu v polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE), kterou v roce 1970 vypracoval Laemmli (Laemmli, 1970). Proteiny se denaturují povařením v pufru s detergentem SDS a redukčním činidlem, nejčastěji 2-merkaptoetanolem. SDS je anionaktivní detergent, který nese poměrně velký náboj, a proto ve vazbě na bílkovinu (tvorba SDS-proteinových micel) vyrovnává nábojové rozdíly bílkovin a ty se proto pohybují v gelu jen podle své velikosti (molekulové hmotnosti). Výjimku tvoří některé glykoproteiny a lipoproteiny, které nejsou dobře saturovány detergentem a také proteiny s vysokým obsahem lysinu a prolinu. Hodnoty relativní molekulové hmotnosti stanovené metodou SDS-PAGE jsou pro účely charakterizace bílkovinného preparátu obecně uznávány. Je však třeba počítat s tím, že SDS obvykle inaktivuje biologicky aktivní látky, zejména enzymy, po elektroforetické separaci je proto již nelze enzym specifickým způsobem (-tj. na základě katalytické aktivity) prokázat. Pokud je elektroforéza použita pro preparativní účely je nutno separované látky z gelové kolony frakcionovaně eluovat, což se při analytickém způsobu nedělá. Elektroforetické podmínky se uspořádají tak, aby separované látky postupovaly shora dolů. Dolní část gelu zasahuje do žlábku, jímž kontinuálně velmi pomalu protéká pufr, ev. jiný eluent. Ten odvádí látky, které postoupily až na konec gelového prstence, do zkumavek na automatickém jímači frakcí umožňujícímu oddělené jímání frakcí. Dobrého výsledku separace lze dosáhnout pouze tehdy, jsou-li jednotlivé zóny látek na koloně dostatečně vzdáleny (několik centimetrů). Detekce proteinů rozdělených na gelu se provádí barvením. Nejčastěji používané je barvení pomocí Coomassie Brilliant Blue (Wilson, 1983) a barvení stříbrem (Merril, 1990). Detekce stříbrem je až stokrát citlivější; je schopno zachytit množství 10 až 100 ng proteinu. Pro diagnostické účely a k detekci velmi malých množství proteinů byla vyvinuta metoda elektroforetického přenesení proteinů z polyakrylamidového gelu na nitrocelulózovou nebo PVDF (polyvinylidene difluorid) membránu, nazvaná imunoblot či Western blot (Baldo and Tovey, 1989; Bers and Garfin, 1985; Bjerrum and Heegaard, 1988; Gershoni, 1987). 13 Název Western blot vznikl jako slovní hříčka dle metody Southern blot (technika detekce DNA) zavedené Edwardem Southernem (Southern, 1975). Analogicky byl vytvořen také název pro metodu detekce RNA Northern blot (Alwine et al., 1977). ,,Přes nesporné kvality Lysenkovy a Mičurinovy vědecké školy se sovětským vědcům nepodařilo v Eastern bloku vyvinou vlastní metodu Eastern blotu." Proteiny rozdělené elektroforézou v gelu jsou přeneseny (blotovány) na membránu, kde mohou být imunochemicky detekovány. Děje se tak pomocí protilátek, jejichž specifita je namířena proti detekovaným molekulám. Neobsazená místa v membráně jsou zablokována jinými proteiny, aby nedocházelo k nespecifickým vazbám protilátek na membránu. Po promytí je membrána inkubována se specifickou primární protilátkou proti hledanému proteinu. Sekundární protilátka, specificky se vázající na protilátku primární, je značena buď enzymem nebo radioaktivním prvkem. Nejčastěji používané enzymy jsou křenová peroxidáza a alkalická fosfatáza. Barevná nebo chemiluminiscenční reakce se substrátem umožní specifickou detekci i nepatrného množství proteinu, které se řádově pohybuje v pikogramech. Další hojně rozšířenou elektroforetickou metodou je izoelektrická fokusace (IEF), která využívá pro separaci amfoterních molekul pH gradientu, který se ustaví mezi dvěma elektrodami pomocí směsi polyamfolytů (Allen and Budowle, 1994; Righetti, 1983). Separovaná látka se pohybuje až do okamžiku, kdy se dostane do oblasti pH shodné s jeho izoelektrickým bodem. Tam se v důsledku vyrovnání nábojového rozdílu její pohyb zastaví a v tomto bodě se bude i dále koncentrovat. Tímto způsobem je možno od sebe oddělit sloučeniny, jejichž izoelektrické body se od sebe liší o 0,001 jednotky pH. Při analýze komplikovaných vzorků často nevystačíme pro dokonalou separaci pouze s jednou z výše popsaných metod. Ke zlepšení separace je možno je navzájem kombinovat. Kromě toho lze libovolnou z popsaných elektroforetických metod kombinovat tak, že dělení jednotlivých frakcí se děje postupně ve dvou navzájem kolmých směrech. Nejčastěji používaná varianta využívá v prvním kroku izoelektrickou fokusaci a ve druhém směru SDS­PAGE a v tomto případě mluvíme o 2D-elektroforéze, která se spolu s hmotnostní spektrometrií stala základním pilířem proteomiky (Hanash, 2000; Bergman et al., 2000). Zvláštním způsobem elektroforézy je kapilární elektroforéza, která vyžívá elektrokinetických principů elektroforézy a elektroosmózy k separaci látek uvnitř křemenné kapiláry o průměru 25-100m (Foret and Bocek, 1989). Existuje v několika provedeních: jako volná elektroforéza, gelová elektroforéza, ale i jako izoelektrická fokusace a izotachoforéza. Kapilární elektroforéza byla např. využita při sekvenování lidské DNA, jejíž délka je okolo tří 14 miliard nukleotidů. Pro tento účel byly vyrobeny přístroje, které obsahovaly desítky až stovky paralelních kapilár, v nichž současně probíhala separace. S rozvojem miniaturizace se elektroforetické a chromatografické metody v budoucnosti mohou realizovat jako laboratoře na čipu v plošném uspořádání. Několik světových firem pracuje na vývoji chemických mikročipů, kdy jsou různými technikami vytvářeny soustavy kanálků v plastických hmotách, křemenu či skle, které při elektroforetické separaci nahradí dosavadní křemenné kapiláry. Na těchto čipech mohou být dále nádobky na další činidla, která se budou přečerpávat a reagovat se vzorky. Vzniklé produkty se mohou analyzovat. Celý proces bude samozřejmě řízen počítačem s příslušným softwarem. Nová technologie v budoucnosti umožní integraci analytické a elektronické části na jednom jediném čipu, což by mohlo vést k masové produkci levných přístrojů pro chemickou analýzu, jež by bylo možné nasadit přímo v terénu. Firma Agilent Technologies Inc. uvedla v roce 2006 na trh kapalinový chromatograf na bázi HPLC-čipu, který může nabídnout více jak 1000 násobně vyšší citlivost než konvenční LC/MS a provádí analýzy až 20x rychleji a s 60 % vyšším rozlišením než konvenční LC systémy při téměř třikrát větší přesnosti. 1.2 Struktura disertační práce V předkládané disertační práci bylo využito chromatografických a elektroforetických metod k purifikaci a analýze různých mikrobiálních proteinů, které byly vhodně doplněny dalšími biochemickými a analytickými metodami nutnými k jejich charakterizaci. Disertační práce je členěna do několika samostatných bloků, které jsou komentovány samostatně a mají svůj vlastní úvod, souhrn výsledků a diskusi. Závěry jsou shrnuty na konci předkládané práce. V první části (kapitola 2) je popsána příprava rekombinantních nukleokapsidových proteinů N evropského a severoamerického sérotypu viru reprodukčního a respiračního syndromu prasat (PRRSV) v eukaryotním bakulovirovém systému genové exprese. Ty byly následně analyzovány pomocí SDS-PAGE a imunoblotu. Exprimované proteiny N obou sérotypů byly izolovány z lyzátu hmyzích buněk pomocí preparativní elektro-eluční SDS-PAGE na zařízení Prep Cell Model 491 (Bio-Rad) ve spojení se systémem FPLC (Pharmacia). Čisté rekombinantní nukleokapsidové proteiny N byly použity jako antigeny k sestavení diagnostického nepřímého ELISA testu k průkazu PRRSV protilátek v sérech prasat. Druhá část (kapitola 3) obsahuje purifikaci a částečnou charakterizaci proteinu schopného přenášet elektrony z cytoplasmatické membrány na periplasmatickou nitritreduktázu 15 v periplasmě mutantního kmene bakterie Paracoccus denitrificans postrádajícího cytochrom c550 pomocí kapalinové chromatografie. SDS-PAGE byla použita k potvrzení čistoty izolovaného proteinu a stanovení jeho molekulové hmotnosti. Ve třetí části (kapitola 4) je prezentována izolace dvou typů rozpustných cytoplasmatických Fe(III)-komplex reduktáz bakterie Paracoccus denitrificans kombinací různých typů kapalinové chromatografie. Tyto enzymy byly dále charakterizovány celou řadou biochemických metod. Byla stanovena jejich molekulová hmotnost, isoelektrický bod, koenzymové složení, terminální sekvence a v případě jednoho z nich potvrzena i oligomerní struktura. V poslední čtvrté části (kapitola 5) je komentována analýza proteinové složky hyfového a sporového antigenu patogenní houby Trichofyton verrucosum pomocí SDS-PAGE. Technikou imunoblotu byla charakterizována molekulová hmotnost jejich proteinů, zodpovědných za indukci specifické imunitní reakce. 16 2. Preparativní SDS-PAGE: Purifikace nukleokapsidového proteinu N viru reprodukčního a respiračního syndromu prasat (PRRSV) exprimovaného prostřednictvím bakulovirového vektoru v hmyzích buňkách 2.1 Úvod 2.1.1 Bakuloviry a jejich expresní systém Bakulovirový expresní systém je jedním z nejvíce využívaných eukaryotních expresních systémů určených k expresi heterologních genů. Strategie bakulovirové exprese je založena na kultuře hmyzích buněk kultivovaných in vitro a infikovaných rekombinantním bakulovirem se začleněným heterologním genem, který je pod kontrolou silného polyhedrinového promotoru. Tento systém umožňuje získat exprimovaný protein v množství dosahující až 30% z celkového množství proteinů. Kromě velkého výtěžku rekombinantního proteinu je předností tohoto systému zachování jeho funkční aktivity, oligomerizace a posttranslačních modifikací, zejména však N- a O-glykosylace, acylace, amidace, karboxymethylace, fosforylace a prenylace a odštěpení signálního peptidu, t.j. procesů vyskytujících se rovněž v savčích buňkách. Hmyzí cytoplasmatické prostředí dovoluje sbalení polypetidového řetězce (folding) shodné s konformací vytvořenou v buňkách přirozeného hostitele. Týká se to zejména intramolekulárních S-S vazeb v rekombinantním proteinu, které, na rozdíl od redukčního prostředí cytoplasmy E.coli (běžného expresního systému), v plném rozsahu reprodukují terciární strukturu původní molekuly. Těchto předností je využíváno při získávání rekombinantních proteinů produkováných v prostředí eukaryotních buněk. V našem případě bylo tohoto systému využito ke konstrukci rekombinantních bakulovirů produkujících nukleokapsidové proteiny N viru reprodukčního a respiračního syndromu prasat (PRRSV). 2.1.2 Historie bakulovirů První zprávy o bakulovirech jsou známy již z počátku 16. století v souvislosti se správou o tzv. ,,chřadnoucí nemoci" (,,wilting disease") postihující larvy bource morušového. 17 Od roku 1940 byly bakuloviry široce používány a studovány jako biopesticidy v zemědělství. Od počátku 90. let jsou tyto viry využívány k produkci rekombinantních proteinů v hmyzích buněčných kulturách. Takto získané proteiny našly široké uplatnění jak ve výzkumu, tak i při konstrukci vakcín v humánní i veterinární oblasti (např. při přípravě vakcíny k prevenci proti H5N1 ptačí chřipce u drůbeže). Objevení schopnosti bakulovirů transdukovat savčí buňky za přítomnosti vhodného promotoru umožnilo od roku 1995 jejich širší uplatnění v lékařství a biotechnologii. 2.1.3 Klasifikace Bakuloviry patří do čeledi Baculoviridae, která se rozděluje na dva rody: Nucleopolyhedrovirus (NPV) a Granulovirus (GV) (Murphy et al., 1995; Fauquet et al., 2005). Rod Nucleopolyhedrovirus má tvar mnohostěnu o velikosti 0.15 x 15 m a dále se dělí dle morfologie na dvě skupiny podle počtu nukleokapsid ve virionu. SNPV (the singlenucleopolyhedroviruses ­ monokapsidové polyhedroviry) obsahují jednotlivé nucleokapsidy ve virionu, zatímco MNPV (multiple-nucleopolyhedroviruses ­ oligokapsidové polyhedroviry) obsahují mnohočetné nucleokapsidy ve virionu. Oba SNPVs a MNPVs mohou obsahovat množství virionů v inkluzních tělískách. Rod Granulovirus má tvar ovicylindrický o velikosti 0.3 x 0.5 m a obsahuje pouze jednu nukleokapsidu ve virionu (obr. 2.1). Bakuloviry jsou druhově specifické, infikují více než 600 druhů bezobratlých. Mezi nejčastější hostitele patří nedospělé larvální formy hmyzu, zejména řády Lepidoptera, Hymenoptera a Diptera a řád korýšů (Decapoda) (Miller, 1995). Replikace bakulovirů v buňkách obratlovců nebyla prokázána. SNPV MNPV GV . Obr. 2.1: Okluzní struktury bakulovirů u rodů Nucleopolyhedrovirus (NPV) a Granulovirus (GV). Vnořené viriony v nukleopolyhedrových okluzích obsahují buď jednotlivé (SNPV) nebo mnohočetné (MNPV) nukleokapsidy. (převzato z msucares.com, www.microbiologybytes.com a www.tuat.ac.jp). 18 2.1.4 Struktura a genom viru Genom bakulovirů tvoří kruhová dvoušroubovicová DNA (dsDNA) o velikosti 80-200 kb, která kóduje okolo 100-200 proteinů. Rozměry bakulovirového nukleokapsidu dosahují 40-50 nm v průměru a délky 200-400 nm (Harrap, 1972b). Nukleokapsid je obklopen proteinovým obalem. Během bakulovirové infekce se vytvářejí dvě formy virových částic. Jedná se o tzv. pučící viriony (BV - budded virus) a viriony shromažděné do okluzí (ODV- occlusion derived virus) (obr. 2.2). Pučící viriony jsou vytvářeny a obalovány při průchodu nukleokapsidů přes plazmatickou membránu směrem k povrchu infikovaných buněk a jsou uvolňovány během GP64 Povrch z infikované buňky Virus DNA Nukleokapsid Pučící virus(BV) Virony shromážděné do okluzí (ODV) Polyhedrální obal (CALYX) Povrch vironu Okluze (Granulin nebo polyhedrin) BV ODV Obr. 2.2: Elektronová mikroskopie a struktura bakulovirových fenotypů tzv.pučících virionů (BV) a virionů shromažděných do okluzí (ODV). (Převzato z www.microbiologybytes.com a z www.cheque.uq.edu.au). sekundární infekce. Pupeny obsahují pouze jednotlivé nukleokapsidy. Pro infekci pomocí BV je nezbytná přítomnost hlavního obalového glykoproteinu GP64 (nenachází se u formy ODV), který je součástí struktur označovaných jako peplomery. Viriony ODV jsou shromážděny do okluzí tvořených proteinem o velikosti 25-33 kDa, produkovaným v obrovském množství. Tento protein se nazývá polyhedrin pro rod Nucleopolyhedrovirus a granulin pro rod Granulovirus. Okluze jsou obklopeny obalem (calyx), který přispívá ke zvýšení stability virionů před působením vnějšího prostředí. Viriony shromažděné do okluzí slouží k šíření primární infekce probíhající ve střevním epitelu hostitele (obr. 2.3). Nukleokapsidy obou forem (ODV a BV) dále obsahují hlavní kapsidový protein, bazický protein vážící se na DNA, který vytváří komplex s virovým genomem. Byly také zjištěny rozdíly v lipidovém složení obalu pro obě formy bakulovirů. Forma BV obsahuje fosfatidylserin, zatímco forma ODV obsahuje fosfatidylcholin a fosfatidyletanolamin (Miller, 1997). 19 Alkalické pH Přijmutí okluze Střední střevo Peritrofická membrána Zadní střevo Rozpuštění okluzí, uvolnění vironů, narušení peritrofické membrányViriony seskupené do okluzí Peritrofická membrána Buňky středního střeva Přední střevo Obr. 2.3: Životní cyklus bakulovirů v infikovaných hmyzích buňkách. V hostitelské buňce jsou tvořeny dvě formy virových částic: viriony shromažděné do okluzí (ODV) v jádře a pučící viriony (BV) dozrávající při průchodu plazmatickou membránou. V přírodě mají okluze funkci ochrannou před působením vnějšího prostředí. Spolu s potravou se dostávají do těla larev hmyzu, kde jsou rozpuštěny ve střevě v alkalickém prostředí a dostávají se fúzí do epitelových buněk střeva. Cílem nukleokapsidu je jádro, kde probíhá replikace a transkripce nukleové kyseliny. Pučící virus podporuje sekundární infekci okolních buněk. (Převzato z www.Invitrogen.com a www.microbiologybytes.com). K nejvíce prostudovaným a využivaným bakulovirům patří virus Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV). Virus byl původně izolován z hmyzích buněk housenek druhu Spodoptera frugiperda (vojnice) (obr. 2.4). Genom AcMNPV obsahuje 134 kbp se 154 otevřenými čtecími rámci (ORF) (Ayres et al., 1994). Hlavní kapsidový protein VP39 spolu s minoritními proteiny tvoří nukleokapsid o rozměrech 21 nm x 260 nm, který obklopuje komplex DNA s p6.9 proteinem (Rohrmann, 1992). Obr. 2.4: Spodoptera frugiperda (vojnice) ­ larva a dospělý jedinec. (Převzato z www.oznet.ksu.edu a mothphotographersgroup.msstate.edu). 20 2.1.5 Příprava rekombinantního bakuloviru Bac-N-Blue DNA Bakulovirový expresní systém využívá přítomnosti rekombinantího bakuloviru se začleněným heterologním genem, který je pod kontrolou silného polyhedrinového promotoru, a buněčných linií hmyzích buněk Sf-9, odvozených od ovárií druhu Spodoptera frugiperda kultivovaných in vitro. Jedním z komerčně dostupných a na našem pracovišti využívaných bakulovirových expresních systémů je Bac-N-Blue Transfection and Expression kit firmy Invitrogen, který využívá jako transferový vektor plazmid odvozený od E. coli nesoucí segment DNA z viru Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV). Tento transferový vektor označený jako pBlueBac4.5/V5-His TOPO nese důležité sekvence nutné pro homologní rekombinaci a replikaci bakuloviru. Jedná se zejména o silný polyhedrinový promotor, DNA sekvence nutné pro kompletaci bakteriálního lacZ genu, gen ORF1629 nutný pro propagaci bakuloviru v hostitelské buňce, polylinker pro vložení cizorodé DNA a signály pro ukončení transkripce a polyadenylaci (Kitts and Possee, 1993). V dalším kroku jsou hmyzí buňky Sf-9 transfekovány směsí purifikovaného transferového vektoru DNA (nesoucího klonovaný gen) a linearizovaného bakuloviru Bac-N-Blue (odvozeného z genomu AcMNPV) metodou kationických liposomů. Dochází k homologní rekombinaci v místech lacZ a ORF1629 a vzniku rekombinantního bakuloviru schopného infikovat hmyzí buňky (obr. 2.5). Díky přítomnosti genu pro produkci -galaktosidázy (lacZ) lze vzniklé klony rekombinantních bakulovirů purifikovat plakovací technikou selekce modrých plaků po 4.-5. dpi. Obr. 2.5: Schéma homologní rekombinace mezi transferovým vektorem pBlueBac4.5/V5-His TOPO a linearizovaným bakulovirem Bac-N-Blue za vzniku rekombinantního bakuloviru Bac-N-Blue. (Převzato z www.Invitrogen.com). 21 2.2 Virus reprodukčního a respiračního syndromu prasat 2.2.1 Úvod a historie Reprodukční a respirační syndrom prasat (PRRS) je infekční onemocnění charakterizované reprodukčními poruchami u prasnic a respiračním onemocněním selat (Denac et al., 1997; Goyal, 1993). Reprodukční poruchy jsou charakterizovány poruchami říje a zabřezávání prasnic, aborty v pozdním stádiu březosti, předčasnými porody a porody slabých selat, která často hynou brzy po narození. U starších selat po odstavu se virus podílí na respiračních problémech, u kanců se v některých případech zjišťuje snížená motilita a zvýšení morfologických abnormalit spermií (Valíček et al., 1999). Původcem onemocnění je RNA virus řazený do čeledi Arteriviridae (Snijder et al., 1998), který se vyskytuje ve dvou antigenních typech ­ evropském a americkém. Virus byl poprvé identifikován v roce 1991 v Holandsku a podle místa izolace byl pojmenován Lelystad virus. Dodnes je považován za referenční evropský kmen (Wensvoort a kol., 1991). V USA bylo onemocnění popsáno dříve než v Evropě (Keffaber et al., 1989), ale virus byl izolován a charakterizován až v roce 1992 (Benfield et al., 1992). Porovnáním nukleotidových sekvencí byl evropský a severoamerický kmen viru PRRS rozlišen na dva odlišné genotypy. 2.2.2 Virus reprodukčního a respiračního syndromu prasat (PRRSV) Virus PRRS je malý obalený virus o průměru 65 nm, jehož genom je tvořen lineární ssRNA s kladnou polaritou o velikosti 15 kb. Virová RNA obsahuje osm otevřených čtecích rámců (,,open reading frames" - ORFs), které se přepisují v infikovaných buňkách jako sada sub-genomových mRNA (Conzelmann et al. 1993; Meulenberg et al., 1993) (obr. 2.6). Do aminokyselinových sekvencí je překládán pouze první otevřený čtecí rámec každé subgenomové mRNA. ORF1a a ORF1b kódují RNA polymerázu, která se účastní replikace viru. Virus PRRS obsahuje tři hlavní strukturální proteiny, a to glykosylovaný obalový protein GP5 (25 kDa), neglykosylovaný membránový protein M (19 kDa) a nukleokapsidový protein N (15 kDa), kódované otevřenými čtecími rámci ORF5,6,7. ORF 2,3,4 definují membránově asociované glykoproteiny GP2, GP3, GP4 s molekulovou hmotností 30, 45 a 31 kDa (Nelson et al., 1993; Mardassi et al., 1995,1996; Meulenberg et al., 1995b) (obr. 2.7). Vysoce bazický nukleokapsidový protein N je hojně zastoupeným proteinem viru PRRS, tvoří až 20-40 % jeho proteinového obsahu (Mardassi et al., 1994) a jako vysoce antigenní se jeví jako vhodný 22 kandidát pro detekci virus-specifických protilátek a diagnózu onemocnění PRRS. M protein je nejkonzervovanějším strukturálním proteinem PRRSV. Podobně jako N protein vyvolává silnou imunitní odpověď. M protein spolu s hlavním obalovým glykoproteinem GP5 vytváří kovalentně vázaný dimer (Mardassi et al., 1996). Narušení této vazby vede ke ztrátě infekčnosti viru (Faaberg et al., 1995). M protein se zřejmě podílí na formaci a pučení virových partikulí v buňce (Meunlenberg, 2000). Role hlavního obalového glykoproteinu GP5 zřejmě spočívá v rozpoznávání receptorů na vnímavých hostitelských buňkách a ve spouštění programované buněčné smrti napadených buněk ­ apoptóze (Suarez et al., 1996). Obr. 2.6: Genom viru PRRS je tvořen +ssRNA (15kb) s osmi ORF. ORF1a a ORF1b kódují protein s replikázovou funkcí. ORF2-7 kódují strukturální proteiny. 23 Obr. 2.7: Schématické znázornění viru PRRS. 2.2.3 Přenos a diagnostika PRRSV K infekcím virem PRRS dochází především vzájemným kontaktem zvířat, semenem infikovaných kanců, transplacentárně a také vzduchem. Primárním místem pomnožení viru PRRS v organismu prasat jsou plicní makrofágy. Imunitní reakce proti antigenům PRRSV je spojena s tvorbou specifických protilátek, které mohou být detekovány v krevních sérech prasat již od 10. až 17. dne po infekci. Protilátky mohou přetrvávat u jednotlivých zvířat různou dobu (až 17 měsíců). Laboratorní průkaz specifických PRRSV protilátek je diagnosticky významné (Nodelijk et al., 1996). K jejich detekci jsou využívány metody jako nepřímý imunoperoxidázový monolayerový test (IPMA), nepřímý imunofluorescenční test (IFA) a virus neutralizační test; pro svou metodickou náročnost jsou však obvykle prováděny jen ve specializovaných laboratořích. Naproti tomu použití ELISA testu (enzyme-linked immunosorbent assay) je vhodné pro diagnostiku PRRS infekce i v běžně vybavených laboratořích. V neposlední řadě se diagnostika viru PRRS opírá o molekulárně-biologické metody, ke kterým patří polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí (RT-PCR), která se používá k průkazu genetických struktur viru PRRS v séru prasat a semeni plemenných kanců (Pšikal et al., 1998). In situ hybridizace (ISH) je používána pro průkaz viru během 24 perzistentní infekce a real-time RT-PCR (qRT-PCR) je určena zejména ke kvantifikaci virové nukleové kyseliny v klinickém materiálu. 2.3 Preparativní SDS-PAGE (Model 491 Prep Cell) Model 491 Prep Cell (Bio-Rad) slouží k izolaci a purifikaci proteinů nebo nukleových kyselin z komplexu směsí kontinuální elektro-elucí. Elekroforéza může probíhat jak za denaturačních tak za nativních podmínek. Během purifikační procedury jsou molekuly, které migrují skrz cylindrickou kolonu s gelem o požadované hustotě, rozděleny do ostrých zón ve tvaru kruhových prstenců. Po doputování na spodní část gelu jsou rozdělené proteiny eluovány pomocí peristaltické pumpy a vedeny středem dutého chladícího jádra do UV monitoru a dále do frakčního kolektoru. V našem případu byla preparativní elektro-eluční SDS-PAGE (Prep Cell Model 491, Bio-Rad) ve spojení se systémem FPLC (Pharmacia) použita k izolaci exprimovaných nukleokapsidových proteinů N viru PRRS evropského a severoamerického sérotypu z lyzátu hmyzích buněk. 2.4 Nepřímá ELISA Imunochemické reakce (tj.reakce antigenů s protilátkami) se využívají velmi často k průkazu a kvantifikaci biologicky aktivních látek pro svoji vysokou specifitu a citlivost. Nejčastěji se využívá imobilizace jednoho z partnerů imunochemické reakce na pevné fázi a oddělování volné a vázané značené reagencie se děje jednoduše promytím. Uvedená varianta imunodetekce se nazývá enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Je známa řada typů technik ELISA, mezi kterými je jednou z nejčastěji využívaných nepřímá ELISA (nELISA). Princip metody spočívá ve vazbě specifických protilátek se specifickým antigenem navázaným na pevnou fázi. Po odstranění nenavázaných protilátek opakovaným promytím, fixované protilátky jsou označeny sekundární antiglobulinovou protilátkou konjugovanou s enzymem (konjugátem). Vzniklý komplex antigen-protilátka-konjugát (běžně značený křenovou peroxidázou) je detekován barevnou reakcí za použití vhodného chromogenu a peroxidu vodíku jako substrátů (obr. 2.8). Metoda je velmi jednoduchá, značené antiglobuliny jsou běžně k dispozici, pouze je třeba mít příslušný antigen v dostatečně čisté formě. V našem případě byly jako antigeny použity purifikované rekombinantní nukleokapsidové N 25 proteiny evropského a severoamerického sérotypu navázané na polystyrenovou podložku. Tímto způsobem fixované antigeny byly inkubovány se vzorky vyšetřovaných prasečích sér a pozitivními a negativními kontrolními séry. Obsahuje-li vzorek séra protilátky proti viru PRRS, naváží se na fixovaný antigen. Tímto způsobem zachycené protilátky (imunoglobuliny) jsou detekovány konjugovanými protilátkami proti prasečím imunoglobulinům. aplikace konjugátu antigen vázaný na pevný nosič aplikace testované protilátky detekce barevné reakce Obr. 2.8: Princip nepřímé ELISA metody. Primární protilátky z testovaného nebo kontrolního séra reagují s antigenem imobilizovaným na pevné fázi. Vázané protilátky jsou detekovány přidáním sekundární protilátky (konjugátu) značené enzymem. 2.5 Cíl práce Pomocí preparativní elektro-eluční SDS-PAGE purifikovat nukleokapsidové proteiny N evropského a severoamerického sérotypu viru PRRS připravené v eukaryotním bakulovirovém systému genové exprese. Takto připravené proteiny využít jako antigeny k sestavení nepřímého ELISA testu k diagnostickému průkazu specifických PRRSV protilátek v sérech infikovaných prasat. 26 2.6 Souhrn výsledků K získání rekombinantních nukleokapsidových N proteinů viru PRRS byly použity terénní izoláty evropského sérotypu PRRSV CAPM V-502 a severoamerického sérotypu VOŠ 2878. Terénní izolát VOŠ 2878 byl izolován na Slovensku v roce 1996 z importovaných prasat. Oba izoláty byly pomnoženy na buněčné linii MARC-145 v Eaglés minimálním esenciálním médiu (EMEM) doplněném 10% bovinním fetálním sérem při 37 C. Celková RNA byla extrahována z infikovaných buněk pomocí Trizolu LS (GIBCO, BRL). Podrobný postup přípravy rekombinantních klonů s vloženým genem pro nukleokapsidový N protein evropského a severoamerického sérotypu viru reprodukčního a respiračního syndromu prasat (PRRSV) je součástí jiné práce (Kosinová, 2007) a zde je popsán jen zkrácený postup jejich konstrukce. Pomocí reverzní transkripce s polymerázovou řetězovou reakcí-RT-PCR (kit Titan One Tube RT-PCR Roche) byly získány produkty o velikosti 409bp kódující 128 aminokyselin nukleokapsidového proteinu N evropského izolátu CAPM V-502 a o velikosti 381bp kódující 123 aminokyselin severoamerického izolátu VOŠ 2878. Pro amplifikace byly použity v případě evropského izolátu CAPM V-502 primery LV7-F2 a LV7-R2, které byly odvozené od sekvencí referenčního kmene Lelystad (GenBank M96262), a v případě severoamerického izolátu VOŠ 2878 primery pIA7-F a pIA7-R odvozených od geneticky příbuzného kmene IAF-exp91 (GenBank PRU02095) (Kosinová, 2007). Purifikované PCR produkty (QIAquick Gel Extraction kit, Qiagen, Valencia, CA, USA) vzniklé RT-PCR byly naklonovány do transferového vektoru pBlueBac4.5/V5-HisTOPO (TOPO TA Cloning kit, Invitrogen, Carlsbad, Ca, USA) za vzniku plazmidů pBlueBac-EU7 a pBlueBac-NA7 obsahujícími geny kódující nukleokapsidový protein N viru PRRS. Po transformaci bakterií a jejich pomnožení, byly z nich izolovány oba plazmidy kitem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Detekce a orientace specifického DNA inzertu v plazmidech byla stanovena pomocí PCR a sekvenace. V dalším kroku byly zkonstruovány rekombinantní bakuloviry rBac-EU7 a rBac-NA7 pomocí bakulovirového expresního systému Bac-N-Blue Transfection and Expression kit (Invitrogen). Hmyzí buňky Sf-9 byly transfekovány směsí purifikovaného transferového vektoru pBlueBac-EU7 nebo pBlueBac-NA7 a linearizovaného bakuloviru Bac-N-Blue (odvozeného z genomu AcMNPV) prostřednictvím kationických liposomů. Došlo k homo- 27 logní rekombinaci v místech lacZ a ORF1629 a vzniku rekombinantního bakuloviru se začleněným heterologním ORF7 PRRSV genem, kompletními geny pro produkci -galaktosidázy (lacZ) a ORF1629 (nutného k jeho propagaci v hostitelské buňce), schopného infikovat hmyzí buňky. Klony rekombinantních bakulovirů rBac-EU7 a rBac-NA7 byly purifikovány plakovací technikou selekce modrých plaků (fenotypový projev occ) v prostředí chromogenního substrátu X-Gal po 4.-5. dpi do stádia získání zcela uniformní populace rekombinantů. Produkce okluzí s fenotypovým projevem occ+ byla detekována u divokých kmenů (,,wild-type") s četností menší než 20 % (obr. 2.9A). Klony rekombinantních bakulovirů po 6. pasáži dosahovaly titr 2.2x108 PFU/ml (rBac-EU7) (obr. 2.9B) a 1.9x106 PFU/ml (rBac-NA7). A B br. 2.9: Detekce klonů rekombinantních bakulovirů pomocí plakové techniky v prostředí odukce a identita obou rekombinantních nukleokapsidových N proteinů rN/EU a rN/N SR30 proti viru PRRS amerického sérotypu (obr. 2.11). O chromogenního substrátu X-Gal (150 g/ml). (A) Fenotypové rozlišení bakulovirových klonů na occ+ u divokých kmenů (,,wild-type") a occu rekombinantních kmenů s genem kódujícím nukleokapsidový protein N viru PRRS. Světelný mikroskop, zvětšeno 100x. (B) Ukázka plakové titrace rekombinantního bakuloviru s genem ORF7/EU v ředění viru od 10-5 -10-7 . Výsledný titr viru dosahoval hodnot 2.2x108 PFU/ml. Pr A s velikostí 15kDa exprimovaných v rekombinantních bakulovirech byly analyzovány pomocí SDS-PAGE v redukujících podmínkách v 12.5% separačním gelu. Specifita rekombinantních N proteinů obou sérotypů byla ověřena imunoblotem. V případě rN/EU bylo použito prasečí sérum proti PRRSV. Specifita rekombinantního proteinu rN/NA byla ověřena reakcí s prasečím sérem proti PRRSV VOŠ2878 (obr. 2.10) a pomocí monoklonální protilátky 28 LMW 1 2 3 4 5 6 7 LMW 8 9 10 9 67 14,4 4 43 30 20 15kDa 15kDa Obr. 2.10: % separační gel) a imunoblot ů rBac-EU7 a rBac-NA7 exprimujících nukleokapsidový protein N o velikosti 15 kDa v reakci s anti PRRSV SDS-PAGE (12.5 rekonbinantních klon polyklonálním prasečím sérem S-841 (rBac-EU7) a s prasečím sérem proti PRRSV VOŠ2878 (rBac-NA7). (10 l standardy molekulové hmotnosti LMW (Pharmacia), 13 l rBac-EU7 (1,3,5,8), 13 l rBac-NA7 (2,6-7,9), 13 l negativní kontrola z neinfikovaných Sf-9 hmyzích buněk (4,10); séra S-841 a antiPRRSV VOŠ2878 byla ředěna 50x, kozí konjugát - ředění 800x). Obr. 2.11: Imunoblot rekombinantních bakulovirových klonů rBac-NA7 exprimujících nukleokapsidový protein N o velikosti 15kDa v reakci s monoklonální protilátkou SR30 (13l rBac-NA7 (A1-D6), ů produkce rN proteinů do inkluzních tělísek a řady nespec 13l negativní kontrola z neinfikovaných Sf-9 hmyzích buněk (KB), monoklonální protilátka SR30 byla ředěna 500x, králičí konjugát 700x). Vybrané klony s největší expresí nukleokapsidového proteinu N byly sloučeny a použity k jeho purifikaci. Z důvod ifických reakcí rekombinantních klonů a samotných Sf-9 buněk s anti PRRSV séry bylo nutné přistoupit k izolaci rN proteinů obou sérotypů z lyzátu hmyzích Sf-9 buněk pomocí preparativní elektro-eluční SDS-PAGE (Prep Cell Model 491, Bio-Rad) (obr. 2.12b) 29 ve spojení se systémem FPLC (Pharmacia) (obr. 2.12a). Buněčná suspenze obsahující rekombinantní protein N byla solubilizována v redukujícím SDS-PAGE vzorkovém pufru a povařena. 3 ml lyzátu obsahujícího 5 x 106 infikovaných buněk bylo vloženo na povrch cylindrické separační gelové kolony široké 3.7 cm a tvořené 1cm (10ml) 4% zaostřovacího gelu a 7.5 cm (65ml) 14% separačního gelu (obr. 2.12c). Purifikace probíhala při konstantním výkonu 12W po dobu 12h. Proteiny obsažené v lyzátu jsou rozděleny do jednotlivých ostrých prstenců na základě molekulové hmotnosti a po elektro-eluci na spodní straně separačního gelu jsou řízeně jímány frakčním kolektorem. ad) ve spojení se systémem FPLC (Pharmacia) použitá k Obr. 2.12a: Preparativní elektro-eluční SDS-PAGE na zařízení Prep Cell Model 491 (Bio-R purifikaci rekombinantních nukleokapsidových proteinů N exprimovaných pomocí bakulovirového expresního systému. b: Detail zařízení Prep Cell Model 491 (Bio-Rad). c: Detail cylindrické separační gelové kolony. 30 Identita a čistota izolovaných N proteinů byla prokázána pomocí SDS-PAGE (obr. 2.13a,b) a jejich specifita potvrzena v imunoblotu protilátkami prasečího séra s obsahem anti- PRRSV Obr. 2.13: ní gel) analýza frakcí získaných z purifikace pomocí preparativní elektro-elu ízení Prep Cell Model 491 (Bio-Rad). Ve frakcích protilátek (obr. 2.14). Výsledek imunoblotu demonstruje vymizení nespecifických reakcí, jejichž přítomnost by byla známkou výskytu balastních proteinových antigenů. Koncentrace purifikovaných nukleokapsidových proteinů N obou sérotypů v jednotlivých frakcích se pohybovala v rozmezí 80 - 250 g/ml, a celkový výtěžek purifikace v jednom běhu dosahoval 1 mg, při zachování čistoty přes 95%. LMW LMW A B94 43 1 67 30 20 SDS-PAGE (12.5% separač ční SDS-PAGE na zař označených šipkou se nachází čistý rekombinantní nukleokapsidový protein N evropského (gel A) a severoamerického (gel B) sérotypu. 15kDa r U 15kD /NA 15kDa rN/EU 15kDa rN/NA N/E a rN 4,4 Obr. 2.14: Imunoblot frakcí obsahující čistý 15kDa rekombinantní nukleokapsidový protein N evropského rN/EU a severoamerického rN/NA sérotypu získaných z purifikace pomocí preparativní prasečími séry obsahujícími protilátky proti elektro-eluční SDS-PAGE na zařízení Prep Cell Model 491 (Bio-Rad). (20l rN/EU v reakci s anti PRRSV prasečím sérem S-841 (ředěno 50x) a 20l rN/NA v reakci s prasečím sérem proti PRRSV VOŠ2878 (ředěno 50x), kozí konjugát - ředění 800x). Frakce obsahující čistý rekombinantní nukleokapsidový protein N obou sérotypů byly testovány jako antigeny v nepřímém ELISA testu s 31 jednomu, nebo druhému z obou sérotypů PRRSV. Vyšetření prokázalo přítomnost křížových reakcí nevelkého rozsahu (tab. 2.1, tab. 2.2). Frakce, které vykazovaly nejvyšší rozdíl absorbancí mezi positivními a negativními kontrolními séry, byly sloučeny a použity jako antigeny k sestavení nepřímého ELISA testu k průkazu specifických protilátek v sérech prasat. Frakce koncentrace/ředění Průměrné Elisa absorbance PKS-841 KV 1228 3810 Jihl.NKS S-93 USA Pro 6, 42-46 2.0 g/ml 1,015 0,101 0,923 0,379 0,15 Pro 6, 42-46 0.5 g/ml 0,1740,698 0,063 0,48 0,11 Ag st. 39+40 2.0 g/ml 0,896 0,071 0,665 0,242 0,108 Pro 7, 36-39 5466 x ř.g/ml, 1000 1,189 0,079 0,952 0,441 0,116 Pro 7, 36-39 5466 x ř.g/ml, 1000 0,805 0,073 0,612 0,243 0,119 Ag st. 39+40 2.0 g/ml 0,999 0,065 0,677 0,256 0,116 Tab. 2.1: čistý rekomb í nukleokapsidový p otein N evrops s rů PRRSV prasečími séry pomocí nep ELIS . (PKS Příklad testování frakcí obsahujících inantn r kého sérotypu znými anti římého A testu S-841, S-93 ­ prasečí séra proti PRRSV evropského sérotypu; NKS, 3810 Jihl. - prasečí negativní séra; KV1228 - prasečí sérum proti PRRSV VR 2332 (americký sérotyp), Pro 6, Pro 7 ­ sloučené frakce obsahující čistý rN/EU ze dvou různých běhů purifikace pomocí zařízení Prep Cell, Ag st. 39+40 ­ dříve izolované a testované frakce rN/EU používané jako srovnávací standard). Číslo PKS 841 NKS AM+ AM- KV1228 KV1228 frakce Lelystad VÚVel Mojžiš Mojžiš Valíček 10x řed. v NKS Fr.23 0,287 0,159 1,095 0,126 0,68 0,212 Fr.24 0,247 0,154 1,027 0,128 0,668 0,211 Fr.25 0,239 0,115 1,015 0,105 0,572 0,138 Fr.26 0,22 0,125 1,009 0,088 0,454 0,155 Fr.27 0,196 0,139 0,765 0,09 0,288 0,112 Fr.28 0,185 0,159 0,499 0,102 0,178 0,116 Tab. 2.2: P testov not frak huj čistý rekombinan leokapsidový protein N severoamerick typ ným RR ečí pomo A říklad ání jed livých cí obsa ících tní nuk ého séro u s růz i antiP SV pras mi séry cí nepřímého ELIS testu. (PKS 841 - prasečí sérum proti PRRSV evropského sérotypu, AM (+) - prasečí sérum proti PRRSV VOŠ2878 (americký sérotyp), AM (-) - prasečí negativní sérum, KV1228 - prasečí sérum proti PRRSV VR 2332 (americký sérotyp). 32 Vedeni snahou zachytit protilátky proti oběma sérotypům viru PRRS ve vyšetřovaných sérech prasat, byla do nepřímého ELISA testu použita směs obou purifikovaných rekomb nELISA inantních proteinů rN/EU a rN/NA. ELISA test využívající oba proteiny jako antigeny byl validován dvěma základními parametry - specifitou a citlivostí. Soubor 552 sér prasat z různých lokalit v České republice byl paralelně vyšetřen tímto testem a standardní diagnostickou soupravou IDEXX HerdCheck ELISA. Porovnání výsledků prokázalo, že specifita a citlivost validovaného testu dosahovaly 92.6 % a 98.3% (tab. 2.3). IDEXX HerdCheck ELISA + + 169 28 197 - 3 352 355 172 380 552 Tab. 2.3: Výsledky paralelního sérologického vyšetření 552 sér prasat pomocí nepřímého ELISA testu a standardní diagnostické oupravy ID HerdCh ELIS e prezentována možnost použití preparativní elektro-eluční SDS-PAGE a jejich následného využití v diagnostické ELISA metodě. í dostate s EXX eck A. 2.7 Diskuse V této práci j pro izolaci proteinových molekul Rozvoj sérologické diagnosticky viru PRRS byl komplikován složitou purifikací přirozených virových proteinů spojenou s jejich nízkou výtěžností. Možnost získáván čného množství viru použitelného pro sérologickou diagnostiku je komplikováno skutečností, že evropský typ viru PRRS se vyznačuje vysokou afinitou k buňkám ochranné bariéry plic, ale nízkou nebo dokonce žádnou afinitou ke stabilním liniím buněčných kultur, které jsou základním substrátem pro jeho izolaci a množení. Z těchto důvodů nelze k jeho izolaci použít standardní stabilní linie prasečích buněk používané pro běžnou virologickou diagnostiku (Pšikal and Kosinová 2006). Problémem byla i nízká produkce virových antigenů v supernatantech infikovaných kultur (Dea et al., 2000). Pokud byly takto získané antigeny testovány v ELISA testu se séry infikovaných prasat spolu s kontrolními séry, bylo 33 pozorováno, že jejich vzájemná reakce vykazuje příliš vysoké pozadí; jinými slovy test byl málo specifický, což je vlastnost významná pro identifikaci negativních sér (Wensvoort et al., 1991; Albina et al., 1992). Většina severoamerických kmenů PRRSV však může být izolována z buněčných kultur MARC-145 nebo CL 2621, odvozených z opičích ledvinných buněk MA 104 (Kim et al., 1993). Úspěšná kultivace PRRSV izolátů v buněčných liniích MARC-145 umožnila laboratorní využití imunoperoxidázového a imunofluorescenčního testu (Yoon et al., 1992; Loemba et al., 1996). Oba testy jsou vhodné pro detekci séropozitivních zvířat, ale jejich nevýhodou je nutnost kultivovat virus v buněčné kultuře, což je drahý a časově náročný postup. Pro detekci virového antigenu připraveného z MARC-145 buněk infikovaných PRRSV byly vyvinuty nepřímé (Albina et al., 1992; Cho et al., 1996; Takikawa et al., 1996) nebo blokující ELISA metody (Sorensen et al., 1997). Ty se však neosvědčily pro nízkou výtěžnost a obtížnou purifikaci přirozených virových proteinů. Z těchto důvodů se začalo využívat jako antigenů rekombinantních proteinů exprimovaných pomocí vhodných expresních systémů, u nichž byl předpoklad vysoké produkce a jednodušší izolace při zachování vysokého výtěžku. Nukleokapsidový N protein o velikosti 15 kDa je malý, vysoce bazický a hojně se vyskytující protein viru PRRS tvořícím až 20-40 % proteinového obsahu (Mardassi a kol., 1994). ý protein N, exprimovaný v hmyzích buňkách (Denac et a Je velmi antigenní a v infikovaných prasatech vyvolává silnou imunitní odpověď, která může být detekována v krevních sérech prasat již od 10. až 17. dne (Yoon et al., 1995; Nelson et al., 1995). Díky uvedeným vlastnostem se stal nukleokapsidový protein N viru PRRS vhodným kandidátem jako antigen pro detekci virus-specifických protilátek. Jejich přítomnost svědčí o prodělané infekci, a proto jejich průkaz může být využit k diagnostice onemocnění (Dea et al., 2000; Witte et al., 2000). V roce 1997 byla popsána nepřímá ELISA k detekci protilátek proti evropskému sérotypu PRRSV používající jako antigen virov l., 1997). Tento test měl však jistá omezení; nebyl vhodný pro detekci protilátek proti severoamerickým typům PRRSV a při dlouhodobém skladování byl nestabilní. Kromě toho se vyznačoval nespecifickým pozadím; zejména při vyšetření terenních vzorků prasečích sér. ELISA test využívající rekombinantní protein N severoamerických sérotypů PRRSV připravený bakteriální expresí byl popsán ve studiích Dea et al. (2000) a Witte et al. (2000). Pro detekci protilátek proti oběma sérotypům byla vyvinuta ELISA metoda používající oba rekombinantní nukleokapsidové proteiny N exprimované v Escherichia coli Seuberlichem (Seuberlich et al., 2002). 34 V námi popsaném postupu jsme k získání rekombinantních nukleokapsidových proteinů N PRRS viru evropského a severoamerického sérotypu použili bakulovirového expresn byly prokázány pomoc proteiny N, musela být solubilizována ve vzorkovém SDS-P st využívající tento antigen sloužil k sestavení diagno inokyselinových sekvencí ího systému. Tento systém dovoluje získání velkého množství rekombinantního proteinu při zachování jeho funkční aktivity, oligomerizace a posttranslačních modifikací. (Meulenberg et al., 1995a; Denac et al., 1997; Kreutz and Mengeling, 1997). Produkce a identita obou rekombinantních nukleokapsidových N proteinů rN/EU a rN/NA o velikostí 15 kDa exprimovaných v rekombinantních bakulovirech í SDS-PAGE. Jejich specifita byla ověřena technikou imunoblotu pomocí positivních prasečích sér obsahujících protilátky proti oběma sérotypům a v případě amerického sérotypu monoklonální protilátkou SR30. Před vlastní separací, suspenze hmyzích buněk, včetně inkluzí obsahujících rekombinantní nukleokapsidové AGE pufru. Pro purifikaci rekombinantních proteinů N obou sérotypů byla zvolena elektro-eluce pomocí preparativní SDS-PAGE na zařízení Prep Cell Model 491 (Bio-Rad). Toto zařízení, zatím nepříliš často využívané, bylo mimo jiné využito pro purifikaci hypofyzárního hormonu z platýze (Einarsdóttir et al., 2007) a inhibitoru matrixové metalloproteinázy-2 (Mandal et al., 2003) v denaturujících podmínkách; cytokininoxidázy za nativních podmínek (Galuszka et al., 2001). Samotná purifikace rekombinantních proteinů N byla zatím uskutečněna pomocí nikl-chelatační chromatografie v prostředí močoviny nebo guanidinu (Seuberlich et al., 2002; Dea et al., 2000; Grebennikova, et al. 2004) nebo elektroeluce v minielutoru z vyříznutých polyakrylamidových gelů obsahující rekombinantní proteiny rozdělených konvenční SDS-PAGE (Kreutz and Mengeling, 1997). Námi použitá metoda navazuje na posledně jmenovaný postup. Díky specializovanému zařízení jej umožňuje racionalizovat: izolace je jednodušší, jednokroková, vysoce účinná a má podstatně vyšší výtěžnost. Skutečnost, že se pracuje v denaturujícím prostředí SDS není na závadu. Zachování nenarušených antigenních determinant PRRSV jsme si již dříve potvrdili reakcí se specifickými protilátkami v imunoblotu. Frakce obsahující čistý rekombinantní nukleokapsidový protein N byly použity jako antigen v nepřímém ELISA testu. Te stického testu k průkazu PRRSV protilátek v sérech prasat. Výskyt křížových reakcí mezi rekombinantními proteiny N obou sérotypů s kontrolními séry opačného sérotypu může být vysvětlen porovnáním am 35 nukleo edků spolu s možností zpracov kapsidového proteinu N severoamerických a evropských sérotypů. Jejich sekvenční homologie dosahuje 97% uvnitř téhož sérotypu (Suárez et al., 1996; Meng et al., 1995) a pouze 60% homologie mezi severoamerickými a evropskými sérotypy (Mardassi et al., 1995; Meng et al., 1995). Ve snaze potlačit významnost těchto křížových reakcí a z důvodu zachycení protilátek proti antigenům evropského i severoamerického sérotypu PRRSV v sérech prasat byla do ELISA testu použita směs obou rekombinantních proteinů rN/EU a rN/NA. Jeho specifita a citlivost, v porovnání s komerční standardní diagnostickou soupravou IDEXX HerdCheck ELISA dosahovala 92.6% a 98.3%. Vysoká citlivost a specifita nepřímého ELISA testu používající purifikované rekombinantní proteiny N umožňující jednoznačné hodnocení výsl at rozsáhlejší soubory vzorků, předurčují tuto metodu nejen k sérologické detekci anti PRRSV protilátek evropského a severoamerického sérotypu u jednotlivých zvířat, ale též pro hromadná vyšetření v rámci ochrany chovů prasat před zavlečením a šířením PRRS infekce. 36 3. Purifikace a částečná charakterizace proteinu schopného přenášet elektrony z cytoplasmatické membrány na periplasmatickou nitritreduktázu v periplasmě mutantního kmene bakterie Paracoccus denitrificans postrádajícího cytochrom c550 pomocí kapalinové chromatografie a SDS-PAGE. 3.1 Úvod - Denitrifikace, denitrifikační enzymy a přenašeče elektronů bakterie Paracoccus denitrificans Bakterie Paracoccus denitrificans patřící mezi -proteobakterie je fakultativně anaerobní striktně respirující mikroorganismus. V anaerobních podmínkách a za přítomnosti dusíkatých terminálních akceptorů má schopnost denitrifikace, při níž je dusičnan enzymaticky redukován až na plynný dusík. Tohoto procesu se účastní vedle membránově vázaných enzymů nitrátreduktázy a NO-reduktázy také dva rozpustné enzymy lokalizované uvnitř periplasmatického prostoru bakterie, a to periplasmatická nitritreduktáza a N2O-reduktáza (Baker et al., 1998). Periplasma je prostor vymezený mezi cytoplasmatickou membránou a vnější membránou a ačkoliv tvoří pouze 5% objemu bakteriální buňky, je místem pozoruhodné biologické aktivity. Je v ní lokalizováno mnoho důležitých procesů, např. část energetického metabolismu, receptory chemotaxe a systémy nutné pro výstavbu buněčné stěny (Perry and Stanley, 1997). V aerobním prostředí P. denitrificans získává energii pro svůj metabolismus a růst aerobní respirací za využití jako terminálního akceptoru kyslíku, vzhledem k vysokému redoxnímu potenciálu páru O2/H2O. Nyní se stručně zmíním o jednotlivých enzymech denitrifikace (podrobnější popis je prezentován např. v práci Koutný, 1999). U bakterie P. denitrificans byla prokázána existence dvou nitrátreduktáz, a to membránové a periplazmatické. Membránový enzym je heterotrimer (-podjednotka obsahuje molybdopterinový kofaktor, součástí -podjednotky je FeS centrum a prostetickou skupinu membránové -podjednotky tvoří hem B) (Ballard and Ferguson, 1988) a je exprimován během denitrifikace za anaerobních podmínek. Periplasmatická nitrátreduktáza je heterodimer, (větší podjednotka obsahuje molybdopterinový kofaktor a FeS centrum, zatímco v druhé podjednotce byly nalezeny dvě místa pro vazbu hemu C) (Bennett et al., 1996; Berks et al., 1994; Breton et al., 1994; Butler et al., 1999; Sears et al. 1995), která je na rozdíl od membránové nitrátreduktázy syntetizována i v přítomnosti kyslíku a její 37 funkce spíše souvisí s pufrováním přebytku redukčních ekvivalentů v respiračním řetězci (Sears et al. 1995; Siddiqui et al., 1993). Periplasmatická nitritreduktáza se skládá ze dvou identických podjednotek obsahujících cytochrom cd1 (de Boer et al., 1994). Asi u jedné třetiny kmenů byla zjištěna existence nitritreduktázy obsahující měď (Hallin and Lindgren, 1999). Oba typy nitritreduktáz nejsou současně obsaženy v jednom organismu. Redukce oxidu dusnatého vznikajícího v periplasmě se děje na vnější straně cytoplasmatické membrány na membránovém enzymu NO-reduktáze, který je složen ze dvou různých podjednotek, z nichž menší obsahuje hem C a větší nese dva hemy B a nehemově vázané železo (Arai et al., 1995; Carr and Ferguson 1990; de Boer et al., 1996; Zumft et al., 1994). Oxid dusný je pak redukován na konečný produkt denitrifikace - molekulu dusíku N2 na rozpustném periplasmatickém enzymu N2O-reduktáze, který je tvořen dvěma stejnými podjednotkami, které obsahují dvě Cu-centra: dvoujaderné CuA a v aktivním centru čtyřjaderné CuZ (Snyder and Hollocher 1987; Brown et al., 2000a, b). Jako fyziologický donor elektronů pro nitritreduktázu, NO-reduktázu, N2O-reduktázu slouží rozpustný periplasmatický protein - cytochrom c550 (Baker et al., 1998), který je produktem genu cycA. Mutantní kmeny defektní v tomto genu, a tedy bez možnosti syntetizovat cytochrom c550, jsou schopny anaerobního růstu a nemají snížené aktivity denitrifikačních enzymů. Z toho vyplývá přítomnost alternativního přenašeče přítomného v periplasmě (van Spannig et al., 1990). Nejpravděpodobnějším kandidátem je pseudoazurin, periplasmatický protein o molekulové hmotnosti 14 kDa obsahující atom mědi. Dalším kandidátem by mohl být protein označovaný jako cytochrom-c-peroxidáza, protože byla izolována frakce periplasmatických proteinů schopná přenosu elektronů, mající cytochrom-cperoxidázovou aktivitu a obsahující hem C (Maťchová et al., 1991). Ačkoliv není cytochromc-peroxidáza řazena k proteinům účastnících se denitrifikace, přesto můžeme najít určité rysy, které ji s anaerobním metabolismem spojují. Exprese proteinu je pozitivně regulována transkripčním faktorem FnrP kontrolujícím expresi denitrifikačních enzymů. 38 3.2 Cíl práce Purifikace periplazmatického faktoru schopného přenášet elektrony z cytoplasmatické membrány na periplasmatickou nitritreduktázu a podílejícího se na nitritreduktázové aktivitě pomocí kapalinové chromatografie. 3.3 Souhrn výsledků Dřívější studie naznačují, že redukce dusitanu sukcinátem v in vitro systému vyžaduje přítomnost faktoru pocházejícího z bakteriální periplazmy (Maťchová et al., 1993). Pro purifikaci periplazmatické složky podílející se na rekonstituční nitritreduktázové aktivitě byla zvolena kapalinová chromatografie. K separaci bylo použito 39 l buněčné kultury mutantního kmene Pd2121 bakterie Paracoccus denitrificans. Purifikace byla provedena v několika po sobě jdoucích krocích. Na začátku byla připravena rozpustná periplasmatická frakce pomocí mírného osmotického šoku s následnou ultracentrifugací. V dalších krocích purifikace probíhala pomocí kapalinové chromatografie (FPLC); a to iontoměničové chromatografie (Sepharose Q), gelové permeační chromatografie (Superose 12) a opět iontoměničové chromatografie (mono Q). Proteiny obsahující obě aktivity - rekonstituční sukcinátnitritreduktázovou a peroxidázovou se navázaly na anex Sepharose Q (16x300mm) v prostředí 20 mM TRIS/HCl, pH 7.3 a eluce probíhala v 600 ml lineárním gradientu 0-1M NaCl. Proteiny obsahující obě aktivity se eluovaly při koncentraci 0.22-0.25 M NaCl (obr. 3.1a). K jednoznačnému oddělení obou aktivit došlo až během separace pomocí gelové permeační chromatografie (GPC) na preparativní koloně Superose 12 (30x600mm) v prostředí 50 mM fosfátu a 150 mM NaCl (obr. 3.1b). V závěrečném kroku purifikace proteinu s rekonstituční aktivitou byla dále s výhodou využita anexová chromatografie na koloně mono Q (1ml) v prostředí 20 mM Na-HEPES, pH 7.2 a eluce probíhala v 20 ml lineárním gradientu 0-300 mM NaCl (obr. 3.1c,d). Purifikovaný protein obsahující požadovanou sukcinát-nitritreduktázovou aktivitu se uvolnil při koncentraci přibližně 235 mM NaCl. Pomocí uvedeného purifikačního postupu bylo získáno 2 mg rekonstitučně aktivního proteinu. Gelová permeační chromatografie na analytické koloně Superose 12 nám posloužila k určení nativní molekulové hmotnosti vyizolovaného proteinu. Pomocí kalibrace kolony proteinovými standardy o definované molekulové hmotnosti byla velikost odhadnuta na 14-15 kDa. Pomocí SDS-PAGE v 12.5% separačním gelu (obr. 3.2) v redukujících podmínkách byla zjištěna čistota a velikost tohoto proteinu. Výsledkem byla existence jedné proteinové linie 39 o molekulové hmotnosti 14 kDa. Z výše uvedených výsledků vyplývá výskyt námi purifikovaného proteinu v nativním stavu v monomerní formě. Pomocí několika dalších nezávislých charakteristik (obsah mědi, spektrum ve viditelné oblasti, atomová absorpční spektroskopie, N-terminální aminokyselinová sekvence) bylo dokázáno, že purifikovaným proteinem je pseudoazurin (Koutný et al., 1999). Obr. 3.1: Eluční profily chromatografické purifikace pseudoazurinu. A: Aniontoměničová chromatografie periplasmatického extraktu P. denitrificans na Sepharose Q předekvilibrované 20 mM Tris/HCl, pH 7.3, eluce v gradientu 0-1 M NaCl + 20 mM Tris/HCl, pH 7.3; B: GPC frakcí s rekonstituční aktivitou na preparativní koloně Superose 12 ekvilibrované v 50 mM fosfátu sodném, 150 mM NaCl, pH 7.4; C: Aniontoměničová chromatografie frakcí s rekonstituční aktivitou z GPC na koloně mono Q v prostředí 20 mM Na-HEPES, pH 7.2 a eluce probíhala v gradientu 0-300 mM NaCl+20 mM Na-HEPES, pH 7.2; D: Opakováná chromatografie na mono Q frakcí s rekonstituční aktivitou získaných v kroku C za stejných podmínek; (nitritreduktázová aktivita po rekonstituci je vyznačena pomocí plných kroužků, peroxidázová aktivita pomocí prázdných kroužků, v C a D případě píky s rekonstituční nitritreduktázovou aktivitou jsou zvýrazněny šipkou). 40 Obr. 3.2: SDS-PAGE v 12.5% separačním gelu purifikovaného pseudoazurinu (barveno pomocí Coomassie Brilliant Blue). A - 50 g standardů molekulové hmotnosti Fluka; B - 4 g pseudoazurinu po finální purifikaci. 3.4 Diskuse Denitrifikační dráha Paracoccus denitrificans zahrnuje vedle membránově vázaných enzymů nitrátreduktázy a NO-reduktázy také dva rozpustné enzymy, které jsou lokalizovány uvnitř periplasmatického prostoru bakterie, a to periplasmatickou nitritreduktázu a N2O-reduktázu (Baker et al., 1998). Rozpustný periplasmatický přenašeč cytochrom c550 je považován za donor elektronů v in vitro systému (Maťchová et al., 1991). Mutantní kmen Pd2121, který je defektní v genu kódujícím cytochrom c550, je schopen anaerobního růstu a nemá snížené aktivity denitrifikačních enzymů. Z toho vyplývá přítomnost alternativního přenašeče přítomného v periplasmě (van Spannig et al., 1990). V podmínkách nedostatku mědi docházelo u mutantního kmene k snížení nitritreduktázové aktivity (van Spannig et al., 1995), a že inhibice této aktivity pomocí dietyldithiokarbamátu (DDC), látky komplexující měď, je více patrná v případě mutantního kmene Pd2121 než u normálního kmene (Moir and Ferguson, 1994). Z výše uvedených výsledků se nejpravděpodobnějším kandidátem jeví periplasmatický protein obsahující atom mědi pseudoazurin. Dalším kandidátem by mohl být protein izolováný z frakce periplasmatických proteinů a schopný přenosu elektronů, mající cytochrom-c-peroxidázovou aktivitu a obsahující hem C (Maťchová et al., 1993). 41 Proto jsme se rozhodli vyřešit tyto nejasnosti purifikací periplazmatického faktoru podílejícího se na rekonstituční nitritreduktázové aktivitě pomocí kombinace iontoměničové a gelové permeační chromatografie. Na iontoměniči ještě nedocházelo k úplnému oddělení peroxidázové a rekonstituční aktivity, protože eluce obou proteinů probíhala při hodnotách 0.22-0.25 M NaCl. Jednoznačné oddělení obou aktivit nastalo až během separace na GPC. Na konci purifikační procedury bylo získáno 2 mg rekonstitučně aktivního proteinu získaného původně z 39 l bakteriální kultury, který se v SDS-PAGE projevil jednou linií o molekulové hmotnosti odhadnuté na 14 kDa. Stejná velikost byla potvrzena použitím analytické GPC na koloně Superose 12, z čehož vyplývá výskyt tohoto proteinu v nativním stavu v monomerní formě. Byly zjištěny další nezávislé charakteristiky purifikovaného proteinu (Koutný et al., 1999). Účinnost purifikovaného proteinu jako elektronového přenašeče byla zjištěna pomocí rekonstituované sukcinát-nitritreduktázové reakce vyznačující se saturovatelností izolovaným proteinem se zdánlivou KM 9.7 M a silným poklesem aktivity se vzrůstající iontovou silou. Absorpční spektrum oxidované formy s maximem při 590 nm, které je typické pro přítomnost Cu centra typu I (Liu et al., 1986). Pomocí atomové absorpční spektroskopie byla zjištěna přítomnost 58 nmol mědi připadající na 1mg proteinu, což odpovídá poměru 0.81 atomu Cu na molekulu proteinu. Všechny tyto skutečnosti směřovaly k tomu, že purifikovaným proteinem je pseudoazurin. Konečným potvrzením této domněnky bylo stanovení N-terminální sekvence 20 aminokyselin purifikovaného proteinu, která vykazovala absolutní shodu s publikovanou sekvencí pseudoazurinu Paracoccus denitrificans (Leung et al., 1997). 42 4. Purifikace a biochemická charakterizace dvou rozpustných Fe(III) reduktáz bakterie Paracoccus denitrificans. 4.1 Bakteriální cytoplasmatické ferrikomplex reduktázy 4.1.1 Výskyt ferrikomplex reduktáz Enzymy označované ferrikomplex reduktázy resp. Fe(III)-komplex reduktázy katalyzují redukci železitých komplexů neproteinové povahy, kde ligandem může být např. nitrilotriacetát, EDTA, citrát nebo siderofor. Tyto enzymy se vyskytují v buňkách řady bakteriálních druhů a to zejména v cytoplasmě, vázané v cytoplasmatické membráně u Agrobacterium tumefaciens (Lodge et al., 1982), Azotobacter vinelandii (Huyer and Page, 1989), Bacillus megaterium (Arceneaux and Byers, 1980), Bacillus subtilis (Gaines et al., 1981), Legionella pneumophila (Johnson et al., 1991), Mycobacterium smegmatis (Brown and Ratledge, 1975), Pseudomonas fluorescens (Halle and Meyer, 1989), Spirillum itersonii (Dailey and Lascelles, 1977) Staphylococcus aureus (Lascelles and Burke, 1978) a Vibrio vulnificus (Mazoy et al., 1999), v periplasmě u Vibrio vulnificus (Mazoy et al., 1999), Legionella pneumophila (Poch and Johnson, 1993). Známé jsou i ferrikomplex reduktázy vylučované bakteriální buňkou do okolního média - u Pseudomonas aeruginosa a Escherichia coli (Vartivarian and Cowart, 1999) nebo Geobacter sulfurreducens (Seeliger et al., 1998). Purifikováno a plně charakterizováno bylo jen několik málo cytoplasmatických ferrikomplex reduktáz (Schröder et al., 2003). Jedná se o ferrisideroforreduktázy Escherichia coli flavinreduktázu, sulfitreduktázu a hemoglobinu podobný protein (HMP - hemoglobin-like protein) (Andrews et al., 1992; Coves and Fontecave, 1993; Coves et al., 1993a, b), ferrikomplex reduktázy z Neisseria gonorrhoeae (La Faou and Morse, 1991), z Pseudomonas aeruginosa (Halle and Meyer, 1992a,b) a z Rhodopseudomonas sphaeroides (Moody and Dailey, 1985). Většina těchto enzymů vykazovala současně flavinreduktázovou aktivitu. 4.1.2 Vlastnosti cytoplasmatických Fe(III)-komplex reduktáz Enzymová aktivita ferrikomplex reduktáz byla často stanovována jako aktivita ferrisideroforreduktázová. Siderofory jsou látky produkované a vylučované bakteriemi do okolního prostředí ve zvýšené míře v podmínkách nedostatku železa. Siderofory komplexují Fe(III) a v této formě je železo transportováno do buňky (Neilands, 1995). Předpokládá se, že 43 některé ferrikomplex reduktázy jsou schopny uvolňovat železo z ferrisideroforů. Siderofory mají mnohem nižší afinitu k dvojmocnému železu než k trojmocnému železu. Např. enzym E.coli původně izolovaný jako NAD(P)H:flavin oxidoreduktáza (Fontecave et al., 1987) byl identifikován jako enzym, který dokáže redukovat i Fe(III) vázané v komplexech se siderofory (Coves and Fontecave, 1993). Enzym v anaerobních podmínkách redukuje s různou rychlostí všechny použité ferrisiderofory z různých bakteriálních druhů. Nutnou podmínkou byla ovšem přítomnost ferrozinu, který se využívá jako chelatační činidlo pro stanovení Fe(II). Za jeho nepřítomnosti je rychlost redukce ferrisideroforů výrazně nižší. K enzymatické redukci flavinu dochází předáním elektronů z NADH nebo NADPH a teprve redukovaný flavin pak může chemicky redukovat Fe(III) vázané ve ferrisideroforu. Při redukci ferrisideroforů flavinreduktázou za přítomnosti ferrozinu reakci silně inhiboval kyslík. Rychlost redukce kyslíku redukovaným flavinem je patrně výrazně vyšší než rychlost redukce komplexu Fe(III). Teprve snížení koncentrace kyslíku v reakční směsi umožnilo zvýšení rychlosti redukce Fe(III) komplexu (Coves and Fontecave, 1993). Andrews se spolupracovníky nalezli u E.coli tři různé proteiny s ferrisideroforreduktázovou aktivitou (označované FsrA, FsrB a FsrC) (Andrews et al., 1992). N-terminální aminokyselinová sekvence enzymu FsrB odpovídá sekvenci HMP proteinu E. coli (hemoglobinu podobného proteinu) (Vasudevan et al., 1991). HMP protein je složen ze tří funkčních domén a to: FAD domény, hemové domény a NAD(P)H vazebné domény. Částečně purifikovaný FsrC protein patrně odpovídá výše zmíněné NAD(P)H:flavin oxidoreduktáze (Andrews et al., 1992; Fontecave et al., 1987). U E. coli s mutací ve fre genu byl purifikován cytoplasmatický enzym s Fe(III)-citrát reduktázovou aktivitou (Coves et al. 1993a) a je zcela identický se sulfitreduktázou (Murphy et al., 1973; Siegel et al., 1973; Siegel and Davis, 1974). Jedná se o protein o molekulové hmotnosti asi 750 kDa tvořený dvanácti podjednotkami dvojího typu (84), přičemž podjednotka (66 kDa) obsahuje FAD a FMN, zatímco podjednotka je hemoprotein obsahující sirohem a [4Fe-4S] klastr (Madden et al., 1989). Rovněž tento enzym katalyzuje redukci celé řady ferrisideroforů pomocí NADPH, zatímco NADH jako donor elektronů neslouží. Ferrisideroforreduktázy NAD(P)H:flavin-oxidoreduktáza a sulfitreduktáza E. coli dále aktivují ribonukleotidreduktázu, jeden z klíčových enzymů živých organismů, která poskytuje deoxyribonukleotidy pro syntézu DNA (Coves et al., 1993a). Purifikován byl také cytoplasmatický enzym ferripyoverdinreduktáza (26-28 kDa) bakterie Pseudomonas aeruginosa, který představuje většinu její buněčné aktivity a pro 44 ferrisideroforreduktázovou aktivitu vyžaduje FMN jako kosubstrát (Halle and Meyer, 1992a). Jako siderofory tato bakterie produkuje pyochelin a pyoverdin. Ferripyoverdinreduktáza způsobuje uvolňování Fe(II) z řady dalších sideroforů (ferrioxaminů B a E, ferrikrocinu, ferrichromu A, ferrienterobaktinu) různého bakteriálního původu. Stejného efektu lze však dosáhnout i chemickou redukcí komplexovaného železa pomocí FMNH2 (Halle and Meyer 1992b). Ferrisideroforreduktázy rodu Pseudomonas opět patří mezi NAD(P)H:flavin oxidoreduktázy. 4.1.3 Funkce cytoplasmatických Fe(III)-komplex reduktáz Konkrétní fyziologická funkce cytoplasmatických ferrikomplex reduktáz v bakteriální buňce nebyla zatím v případě žádného z těchto enzymů definitivně vysvětlena. Je dosti pravděpodobné, že jednotlivé Fe(III)-komplex reduktázy budou mít v organismu různé funkce a není ani vyloučena možnost, že jeden enzym ovlivňuje více buněčných procesů. Konverze Fe(III) na více rozpustný Fe(II) obecně zvyšuje biodostupnost železa buď vně buňky (spojení se vzrůstajícím transportem Fe(II)) nebo intracelulárně (uvolnění nahromaděného železa z ferrisideroforů (Cowart, 2002). Tato funkce skutečně u řady Fe(III)-komplex reduktáz pozorována byla, ačkoli tyto enzymy jsou produkovány konstitutivně, vylučování sideroforů buňkou je výrazně stimulováno nedostatkem železa v buňce. Další možností je regulace intracelulární koncentrace železa. Jedná se o zvyšování koncentrace Fe(II) v buňce na úkor Fe(III) za normálních růstových podmínek a v tomto případě jde spíše o regulaci poměru intracelulárních koncentrací [Fe(III)]/[Fe(II)]. Fe(III)-komplex reduktázy mohou ovlivňovat redoxní stav Fe-kofaktorů některých proteinů. Např. aktivita regulačního proteinu FnrP, který v aktivní formě spouští expresi nitrátreduktázy, prvního enzymu denitrifikační dráhy, by mohla být regulována změnou oxidačního stavu FeS kofaktoru. Fe(III) z prostředí může sloužit uvnitř bakterie jako redukovatelný akceptor dovolující regeneraci NAD+ nebo jako terminální elektronový akceptor v anaerobní respiraci spojené s translokací protonů a generováním transmembránového potenciálového rozdílu (Short and Blakemore, 1986; Dobbin et al., 1996). Mimo jiné byla popsána aktivace ribonukleotidreduktázy ferrisideroforreduktázami E. coli (Coves et al., 1993a). Pro tuto aktivitu byla prokázána nezbytnost flavinů. Zda to je hlavní fyziologická úloha, však nebylo potvrzeno. 45 4.2 Měření velikosti 4.2.1 Měření velikosti částic pomocí dynamického rozptylu světla (DLS) a molekulové hmotnosti pomocí statického rozptylu světla (SLS) Při zjišťování velikosti jednoho z enzymů s Fe(III)-komplex reduktázovou aktivitou byla mimo jiných využita metoda dynamického a statického rozptylu světla. Velikost částice vyjádřená jako hydrodynamický poloměr Rh je rovna průměru koule, která se pohybuje v roztoku stejnou rychlostí jako měřená částice. Zetasizer NANO ZS ZEN 3600 (Malvern) měří velikost částic měřením Brownova pohybu částic ve vzorku pomocí metody dynamického rozptylu světla - DLS. Brownův pohyb je náhodný pohyb částic v kapalině způsobený vzájemnými kolizemi molekul. Rychlost náhodného pohybu částic slouží k výpočtu jejich velikosti. Malé částice se pohybuji v roztoku rychle, zatímco větší částice se pohybují pomaleji. Velikost částice je tedy určena pomocí vztahu mezi rychlostí difuze a velikostí částice pomocí Stokes-Einsteinova vztahu. Princip dynamického rozptylu světla (fotonové korelační spektroskopie) a celého přístroje Zetasizeru (Malvern) je v ozáření částic laserem a analýze fluktuací intenzity rozptýleného světla pomocí detektoru, digitálního korelátoru, který měří podobnost dvou signálů po určitém časovém úseku. Protože velké částice se pohybují pomalu, je u velkých částic malá fluktuace změn intenzity rozptýleného světla. Pro malé částice platí opak. Molekulová hmotnost oligomerního enzymu s Fe(III)-komplex reduktázovou aktivitou byla určena za využití statického rozptylu světla ­ SLS, což je neinvazivní metoda založená na charakterizaci molekul v roztoku. Tato metoda narozdíl od DLS neměří fluktuace intenzity rozptýleného světla v čase, ale využívá průměrnou intenzitu rozptýleného světla v určitém časovém úseku. Naakumulovaná intenzita rozptýleného světla je potom přiřazena k určité koncentraci vzorku, která je součástí koncentrační řady. Tato metoda umožňuje vypočítat jednak molekulovou hmotnost Mr a jednak druhý viriální koeficient A2, která popisuje míru interakce mezi částicemi a solventem. Pokud je A2 >0 částice jsou plně rozpuštěny v solventu. A2 < 0 částice mají tendenci agregovat. A2 = 0 částice má stejnou afinitu k solventu i k jiným částicím, jde o theta solvent. Princip teorie SLS je měření vzorků v různých koncentracích a aplikaci Rayleighova vztahu, který popisuje intenzitu rozptýleného světla na částici v roztoku. 46 R Rayleigh poměr rozptýleného světla k náhodnému světlu, C koncentrace, M molekulová hmotnost Mr, P úhlová závislost rozptylu světla částicí. Tato funkce je kulově symetrická pro částice s průměrem výrazně menším než je délka použitého světla, K optická konstanta definovaná podle vztahu dn/dc ­ diferenciální refraktivní index. Vyjadřuje změnu refraktivního indexu s koncentrací. Pro měření molekulové hmotnosti bylo třeba změřit intenzitu rozptylu známého standardu, který pak byl porovnán s analytem o známém R. Jako standard byl použit toluen. Pro výpočet R analytu byla použita následující rovnice IA - zbytková intenzita rozptylu ( tj. I vzorku ­ I solventu), IT ­ intenzita rozptylu toluenu, no ­ refr. index solventu, nT ­ refr. index toluenu, RT ­ Rayleigh poměr toluenu. Obr. 4.1: Zetasizer měří intenzitu rozptýleného světla (K/CR) v různých koncentracích (C) pod stejným úhlem. Takovéto grafické vynesení je nazýváno Debye plot a umožňuje vypočítání molekulové hmotnosti a druhého viriálního koeficientu. Molekulová hmotnost je určena z průniku na ose y, tj. K/CR=1/Mr v Daltonech. Druhý viriální koeficient A2 je určen z gradientu Debye plotu. 47 4.2.2 Měření molekulové hmotnosti pomocí hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF Metody hmotnostní spektrometrie jsou založeny na rozdělení nabitých částic podle poměru jejich hmotnosti ku náboji (m/z) v elektrickém nebo magnetickém poli. Ke stanovení hmotnosti velkých molekul se často používá hmotnostní spektrometrie s ionizací a desorpcí laserem v přítomnosti matrice (MALDI, matrix assisted laser desorption-ionization) v kombinaci s analyzátorem doby letu (TOF, time-of-flight). Pro ionizaci se využívá tzv. matrice ­ látky, která absorbuje energii laseru a předá ji analyzované látce, která se pak desorbuje do plynné fáze v podobě molekulárního iontu, přičemž nedochází k její nežádoucí fragmentaci. Ionty analyzované látky jsou urychleny elektrickým polem (20­30 kV) a přes uzemněnou mřížku vstupují do analyzátoru TOF, kde se pohybují rychlostí závislou na jejich poměru hmotnosti a náboje. Zaznamenáním dopadu iontu na detekční systém se získá údaj o době letu, ze kterého se odvodí poměr m/z a z něj i molekulová hmotnost látky (Lewis et al., 2000). 4.2.3 Síťování pomocí 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (EDC) s N-hydroxysulfosukcinimidem (sulfo-NHS) Karbodiimidy rozpustné ve vodě jsou nejčastěji používanými konjugačními činidly pro biochemické účely. Vytvářejí amidové vazby mezi karboxylátem jedné molekuly a primárním aminem druhé molekuly, aniž by při konjugaci došlo k inkorporaci jakýchkoliv dalších atomů. N-substituované karbodiimidy reagují s karboxylovými kyselinami za vzniku vysoce reaktivních O-acylizomočovinových intermadiátů. Tyto aktivní estery mohou potom reagovat s nukleofilem jako je primární amin, což vede ke vzniku amidové vazby a k uvolnění vedlejšího produktu, kterým je izomočovina. Pokud jedna ze složek konjugační reakce má karboxylové i aminové skupiny, může konjugace vést k její polymerizaci, protože aktivní intermediát může reagovat s další molekulou téhož druhu. O-acylizomočovinový aktivní intermediát může reagovat i s jinými nukleofily. Může být například atakován sulfhydrylovými skupinami za vzniku thiolesterových vazeb. Tyto thiolestery však nejsou tak stabilní jako vazba s aminem. Roli atakujícího nukleofilu mohou hrát i kyslíkové atomy molekul vody. Hydrolýza vodou je hlavní konkurenční reakce ve vodných prostředích ­ probíhá s rychlostní konstantou řádově v sekundách (Hoare and Koshland, 48 1967). Dochází při ní k rozštěpení O-acylizomočovinového aktivního intermediátu na izomočovinu a karboxylovou skupinu, která je tímto regenerována. Pro síťování FerB jsme zvolili 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid hydrochlorid (EDC) ve spojení s N-hydroxysulfosukcinimidem (sulfo-NHS) (Hermanson, 1996), který je také rozpustný ve vodě. Výhoda přidání sulfo-NHS do EDC reakcí spočívá ve zvýšení stability aktivního intermediátu, který pak reaguje s atakujícím aminem. Jestliže cílový amin nenajde aktivní intermediát dříve, než tento podlehne hydrolýze, nedojde k žádoucí konjugaci. Tvorba sulfo-NHS intermediátu reakcí hydroxylové skupiny sulfo-NHS s O-acylizomočovinovým aktivním intermediátem prodlužuje poločas rozpadu aktivované karboxylové skupiny řádově na hodiny. Výsledný produkt této dvoustupňové reakce je stejný jako v případě samotného EDC: aktivovaný karboxylát reaguje s cílovým aminem za vzniku stabilní amidové vazby (obr. 4.2). Přidání sulfo-NHS k reakčním směsím pro konjugaci pomocí EDC vede k vysoké účinnosti a dramatickému zvýšení výtěžku konjugace. Vznikající sulfo-NHS estery jsou rozpustné ve vodě, stabilní a podléhají hydrolýze relativně pomalu. V přítomnosti aminových nukleofilů, které mohou atakovat karbonylovou skupinu esteru, se N-hydroxysulfosukcinimidová skupina rychle odštěpuje za tvorby stabilní amidové vazby s aminem. Sulfhydrylové a hydroxylové skupiny mohou také reagovat s těmito aktivními estery, ale produkty těchto reakcí ­ thioestery a estery ­ jsou relativně nestabilní. Obr. 4.2: Účinnost konjugace pomocí EDC může být zvýšena tvorbou sulfo-NHS esterových intermediátů. Sulfo-NHS ester má ve vodném roztoku větší stabilitu než aktivní ester vzniklý při reakci samotného EDC s karboxylátem. Tato dvoustupňová reakce poskytuje vyšší výtěžky amidové vazby. 49 4.3 Cíl práce Charakterizovat a purifikovat cytoplasmatické enzymy bakterie Paracoccus denitrificans projevující Fe(III)-reduktázovou aktivitu. 4.4 Souhrn výsledků 4.4.1 Purifikace a biochemická charakterizace Fe(III)-komplex reduktáz bakterie Paracoccus denitrificans Přítomnost železa jako kofaktoru v FnrP proteinu bakterie P. denitrificans a jeho význam při regulaci anaerobního metabolismu nás vedlo ke snaze prostudovat přítomnost ferrikomplex reduktáz této bakterie. Když byla v cytosolu P. denitrificans nalezena Fe(III) reduktázová aktivita (Kučera and Maťchová, 1997), bylo provedeno srovnání specifity ferrikomplex reduktázové aktivity v cytosolu P. denitrificans vůči různým komplexům Fe(III) (tab. 4.1) (Mazoch, 2004). Vzhledem k tomu, že doposud známé ferrikomplex reduktázy jsou Forma Fe(III) Rychlost tvorby komplexu Fe(II)(ferrozin)3 [nmol.min-1 .(mg proteinu)-1 ] Aerobní podmínky, přítomnost 0,05 mM FMN Anaerobní podmínky, přítomnost 0,05 mM FMN Aerobní podmínky, bez FMN FeEDTA 0,30 (0,03) NM 0,14 (0,04) FeEGTA 12,6 (0,6) NM 9,07 (0,82) Fe(maltol)3 19,4 (0,6) 15,9 (0,7) 0,98 (0,11) FeNTA 23,5 (0,5) 21,8 (2,5) 8,78 (1,08) FeCl3 5,01 (0,34) NM 0,11 (0,01) Tab. 4.1: Rychlost redukce Fe(III) komplexů cytosolovým extraktem P. denitrificans. Chemická redukce Fe(III) komplexů byla testována s komplexem Fe(III)(maltol)3 a s Fe(III)NTA. Výsledky pro Fe(III)NTA [nmol.min-1 (mg proteinu)-1 ]*: i) bez cyt.: 0,41 (0,06), ii) bez NADH: 0,65 (0,02). Výsledky pro Fe(III)(maltol)3: i) bez cyt. : 0,39 (0,03), ii) bez NADH: 0,31. * Výsledky pro měření bez cytosolu jsou v jednotkách nmol.min-1 . NM ­ nebylo měřeno; v závorkách jsou směrodatné odchylky (Mazoch, 2004). 50 aktivovány buď flavinem nebo jsou plně závislé na přítomnosti flavinu, do reakční směsi byl přidáván FMN. V některých případech byly naměřeny významné aktivity ferrikomplex reduktáz s Fe(III) substráty i bez přídavku FMN. Nejvyšší rychlosti redukce Fe(III) bylo dosaženo s komplexem Fe(III)-nitrilotriacetát (Fe(III)NTA), a to jak v přítomnosti FMN, tak i bez přídavku FMN. Měření byla prováděna za aerobních podmínek. Měření v anaerobním podmínkách nemělo podstatný vliv na rychlost reakce. Komplex Fe(III)NTA byl následně používán ke stanovování aktivity frakcí během purifikace i ke kinetickým studiím. Z prvních kroků purifikace bylo zřejmé, že v cytosolovém extraktu P. denitrificans se vyskytují dva enzymy (označené jako FerA a FerB), které jsou zodpovědné za ferrikomplex reduktázovou aktivitu cytosolu. Enzymy byly purifikovány do vysokého stupně čistoty. V případě FerA byl stupeň přečištění 1424× a v případě FerB 568×. Výsledky purifikace obou enzymů jsou shrnuty v purifikačních tabulkách (tab. 4.2). FerA Volume Total protein Total activity Specific activity Purification factor Yield ml mg nkat nkat.mg-1 -fold % Cytosolic extract 25.5 517.4 120.3 0.23 1 100 Sepharose Q 2.8 7.81 59.1 7.57 32.9 49.13 Polybuffer exchanger 96 2.8 0.155 15.9 102.58 446 13.22 Superose 12 HR 10/30 4.0 0.028 9.17 327.50 1424 7.62 FerB Volume Total protein Total activity Specific activity Purification factor Yield ml mg nkat nkat.mg-1 -fold % Cytosolic extract 25.5 517.4 85.50 0.17 1 100 Sepharose Q 2.85 23.73 38.37 1.62 9.8 44.9 Polybuffer exchanger 74 1.5 0.434 16.47 37.93 230 19.3 Polybuffer exchanger 74 1.0 0.069 5.22 75.23 457 6.1 Superose 12 HR 10/30 0.6 0.024 2.25 93.89 568 2.6 Tab. 4.2: Purifikace Fe(III) reduktáz P. denitrificans. Aktivita byla měřena nárustem absorbance Fe(II)(ferrozin)3 komplexu při 562 nm. Specifická aktivita je vyjádřena jako enzymová aktivita vztažená na mg celkového proteinu. Purifikace byla provedena v několika po sobě jdoucích krocích. Na začátku byla připravena rozpustná buněčná frakce pomocí French pressu s následnou ultracentrifugací, poté purifikace probíhala pomocí kapalinové chromatografie (FPLC); a to iontoměničové 51 chromatografie (HP Sepharose Q), chromatofokusace (Mono P) a gelové permeační chromatografie (Superose 12), s případným dočištěním pomocí nativní elektroforézy na polyakrylamidovém gelu s následnou elektro-elucí z gelu. Oba enzymy se navázaly na aniontoměniči HP Sepharose Q v prostředí 20 mM TRIS/HCl, pH 7.4 a eluce probíhala v gradientu 0-1 M NaCl. FerA se eluoval při koncentraci 50-150 mM NaCl a FerB v podmínkách 250-400 mM NaCl (obr. 4.3). I II 0-1 M NaCl 0 1 2 3 4 5 6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Čísla frakcí 0 4 8 12 16 20 A(280nm) Aktivita,nkat Obr. 4.3: Aniontoměničová chromatografie cytosolického extraktu Paracoccus denitrificans na HP Sepharose Q předekvilibrované 20 mM Tris/HCl, pH 7.4, eluce byla provedena v gradientu 0-1 M NaCl, pík I odpovídá enzymu FerA a pík II enzymu FerB. Při purifikaci reduktáz byla dále s výhodou využita chromatofokusace na koloně Mono P. V případě FerA byl kvůli jeho vyšší citlivosti ke změnám pH využit jen jeden chromatofokusační krok v prostředí 75 mM Tris/HAc, pH 9.3 s následnou elucí pomocí Polybuffru 96 (obr. 4.4). Při purifikaci FerB byla chromatofokusace provedena v prostředí 25 mM kyseliny bis Tris/iminodioctové, pH 7.1 a enzym FerB byl eluován pomocí Polybuffru 74, pH 4.0 ve dvou po sobě následujících purifikačních krocích (obr. 4.5). Při chromatofokusaci jsme rovněž změřili pH odpovídající isoelektrickým bodům obou enzymů: pro FerA je to 6.9, pro FerB 5.5. 52 Gradient pH 9-6 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0 10 20 30 40 50 60 Objem, ml A(280nm) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 pH 6.9 Aktivita,nkat 1M NaCl Obr. 4.4: Chromatofokusace aktivních frakcí I po iontoměničové chromatografii na koloně Mono P HR 5/20 předekvilibrované 75 mM Tris/HAc, pH 9.3, eluce byla provedena v gradientu Polybufferu 96, pH 6.0. Gradient pH 7-4 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 10 20 30 40 50 60 Objem, ml A(280nm) 0 2 4 6 8 10 12 14 pH 5.5 Aktivita,nkat1M NaCl Obr. 4.5: Chromatofokusace aktivních frakcí II po iontoměničové chromatografii na koloně Mono P HR 5/20 ekvilibrované 25 mM kys. bis Tris/iminodioctovou, pH 7.1 a eluce byla provedena v gradientu Polybufferu 74, pH 4.0. Při optimalizaci purifikačního postupu byla použita i hydrofobní chromatografie na kolonách Phenyl-Superose nebo Phenyl-Hema-Bio 1000 v prostředí 1.5 M síranu amonného + 50 mM Tris/HCl, pH 7.4 a eluce byla provedena poklesem koncentrace síranu amonného (1.5-0 M). Eluce FerA nastala až při velmi nízké koncentraci síranu amonného (80-90% gradientu), zatímco FerB byl eluován již při 45-50% gradientu (obr. 4.6). FerA tedy 53 prokazoval výrazně silnější hydrofobní interakci s matricí, což korespondovalo s výsledky purifikace pomocí iontoměničové chromatografie. III Gradient 1.5-0 M (NH4)2SO4 0 0,5 1 1,5 2 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Objem, ml A(280nm) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 Aktivita,nkat Obr. 4.6: Hydrofobní chromatografie cytosolu P. denitrificans v prostředí 1.5 M (NH4)2SO4 na koloně Phenyl Hema-Bio 1000 ekvilibrované 50 mM Tris/HCl, pH 7.4 + 1.5 M (NH4)2SO4, eluce byla provedena v poklesu gradientu 1.5-0 M (NH4)2SO4, pík I odpovídá FerA a pík II FerB. 4.4.2 Stanovení velikosti FerA a FerB Gelová permeační chromatografie na koloně anal. Superose 12 byla použita jako záverečný krok při purifikaci enzymů a zároveň nám posloužila k určení nativní molekulové hmotnosti FerA a FerB. Pomocí kalibrace kolony proteinovými standardy o definované molekulové hmotnosti byla velikost enzymů odhadnuta na 20 kDa pro FerA a 52 kDa pro FerB (obr. 4.7). Z těchto výsledků se dalo usuzovat na existenci FerA jako monomeru a FerB vykazoval oligomerní strukturu, pravděpodobně jako homodimer. Oligomerní struktura FerB byla potvrzena měřením velikosti a molekulové hmotnosti pomocí metody rozptylu světla. Velikost částice nativního ezymu FerB byla měřena pomocí dynamického rozptylu světla (DLS) (tab. 4.3). Molekulová hmotnost byla odečtená z lineární regrese naměřených velikostí standardů o definované molekulové hmotnosti (obr. 4.8) a dosahovala hodnoty 49 kDa. Molekulová hmotnost FerB měřená pomocí statického rozptylu světla (SLS) v koncentrační řadě 0.225-0.9 mg/ml a určená pomocí Debyeova plotu, dosahovala hodnoty 55 kDa (obr. 4.9 a tab. 4.4). Z těchto výsledků se dalo usuzovat na výskyt FerB jako homodimeru. 54 FerA FerB 0 0.02 0.04 0.06 0 5 10 15 Elution volume (ml) Absorbanceat280nm 4 4.5 5 5.5 12 13 14 15 16 Elution volume (ml) logMW Obr. 4.7: Gelová pemeační chromatografie enzymů FerA a FerB na koloně anal. Superose 12 ekvilibrované 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4. kalibrace DLS y = 4,3198x - 0,9327 R2 = 0,9977 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 0,5 1 1,5 2 2,5 log M IntenzitaDLS(nm) M (kDa) velikost (nm) Ribonukleáza A 13,7 3,9 Karbonikanhydráza 29 5,4 -amyláza 55 6,7 ADH 150 8,4 FerB 49,1 6,4 Tab. 4.3 a Obr. 4.8: Měření velikosti FerB pomocí dynamického rozptylu světla (DLS). Velikost FerB byla určena z lineární regrese naměřených velikostí standardů o definované molekulové hmotnosti (viz. výše). 55 konc. FerB Intensita KC/RoP g/ml kcps 1/kDa 0,000225 153 1,84E-08 0,00045 245 1,87E-08 0,0009 424,2 1,91E-08 Debye plot 0.0000 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.0010 1.7×10-8 1.8×10-8 1.9×10-8 2.0×10-8 2.1×10-8 2.2×10-8 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Intensita Debye koncentrace FerB (g/ml) KC/RoP(1/kDa) Intensita(kcps) Tab. 4.4 a Obr. 4.9: Určení molekulové hmotnosti FerB pomocí statického rozptylu světla (SLS). Byla měřena intenzita rozptýleného světla v koncentrační řadě 0.225-0.9 mg/ml FerB a molekulová hmotnost byla určena pomocí Debyeova plotu z průniku na ose y, tj. K/CR=1/M a dosahovala motnostní spektrometrie - MALDI-TOF jsme posléze molekulové hmotnosti monomerů upřesnili - pro FerA byla zjištěna výsledná molekulová hmotnost 18 814 Da nebo 18 917 hodnoty 55 kDa. SDS-PAGE určila molekulové hmotnosti monomerů FerA i FerB na 18 kDa (obr. 4.11). Pomocí h Da (nebylo možno zjistit, jakým formám proteinu odpovídají dvě maxima ve spektru), pro FerB molekulová hmotnost monomeru činí 20 196 Da (obr. 4.10). 56 a.i. FerA 18 814.282 18 916.700 a.i. 20 195.996 FerB Obr. 4.10: MALDI-TOF spektra monomerů enzymů FerA a FerB. 57 Obr. 4.11: SDS-PAGE purifikace Fe(III)-komplex reduktáz bakterie P. denitrificans v 10-15% separačním gelu (barveno stříbrem). (1- 10 g původního cytoplasmatického extraktu, 2- 0,3 g purifikovaného FerA, 3- 1 g purifikovaného FerB, 4- standardy molekulové hmotnosti Fluka). K průkazu oligomerní struktury FerB byla využita metoda síťování pomocí 1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (EDC) s N-hydroxysulfosukcinimidem (sulfo-NHS) (Hermanson, 1996). Pufr pro konjugační reakci nesmí obsahovat aminové, karboxylové ani jiné skupiny, které by mohly reagovat s karbodiimidem, proto byl vzorek FerB pětkrát dialyzován proti tisícinásobnému objemu 0.1 M fosfátového pufru o pH 7.4. Zásobní roztoky EDC (Sigma, skladován pod argonem) i sulfo-NHS (Pierce, Illinois, U.S.A) byly připraveny bezprostředně před konjugací. Koncentrace proteinu v reakční směsi byla 50 M a koncentrace sulfo-NHS byla 5 mM. Konjugace byla provedena se šesti různými koncentracemi EDC: 50 M, 500 M, 5 mM, 50 mM, 100 mM a 1 M. Po 2 h byl výsledek reakce analyzován pomocí hmotnostní spektrometrie - MALDI-TOF (obr. 4.12), kde byl nalezen produkt o velikosti 20.2 kDa, který odpovídá velikosti monomeru FerB. Z obrázku je patrný postupný úbytek monomeru se vzrůstající koncentrací EDC (při koncentraci EDC 50 mM a 100 mM se již monomer nevyskytoval). Při použití 1M EDC nebylo možné z důvodů vysoké koncentrace soli a nezaschnutí matrice se vzorkem hmotnostní spektrum měřit. Signál odpovídající dimeru FerB v hmotnostních spektrech pozorován nebyl pravděpodobně v důsledku vysokých koncentrací síťovacích činidel, jejichž negativní účinek roste s hmotností ionizovaných molekul. 58 Obr. 4.12: MALDI-TOF MS spektra monomerů FerB síťovaných různými koncentracemi 1-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl) karbodiimidu (EDC) s N-hydroxysulfosukcinimidem (sulfo-NHS). (Vz.0­bez přídavku EDC (nesesíťovaný FerB), Vz.1-5 ­ 50 M, 500 M, 5 mM, 50 mM a 100 mM EDC. Konc. FerB ­ 50 M. Konc. sulfo-NHS 5 mM ve všech vzorcích mimo Vz.0) Po odebrání vzorků na MALDI-TOF analýzu byl k reakční směsi přidán SDS-PAGE vzorkový pufr v poměru 1:1. Protože EDC může tvořit stabilní komplex s dostupnými sulfhydrylovými skupinami (Carraway and Triplett, 1970) a protože koncentrace merkaptoetanolu v SDS-PAGE redukujícím vzorkovém pufru zaručovala dostatečnou nabídku sulfhydrylových skupin, nebylo potřeba žádného dalšího kroku pro odstranění zbývajícího EDC z reakční směsi. Reakční cyklus aktivního izomočovinového intermediátu byl zastaven dostatečným nadbytkem glycinu obsaženého v SDS vzorkovém pufru. Během konjugace ani po ní nebyla 59 pozorována žádná precipitace. Vzorky obsahující síťovaný FerB byly separovány pomocí SDS-PAGE v 12.5% gelu, který byl obarven pomocí Coomassie blue (obr. 4.13). V obarveném elektroforetickém gelu je při použití 500 M EDC patrná dominantní linie v oblasti cca 18 kDa, která odpovídá velikosti monomeru FerB v SDS-PAGE. V případě koncentrace 50mM EDC a 100mM EDC byla pozorována výraznější linie v oblasti přibližně cca 36 kDa, což odpovídá dvojnásobku monomeru FerB v SDS-PAGE (monomerní linie zcela vymizela). 94 67 43 30 20 14,4 D1 D2 M1 M2 1 2 3 4 5 6 94 67 43 30 20 14,4 D1 D2 M1 M2 1 2 3 4 5 6 Obr. 4.13: SDS-PAGE produktů síťovaní FerB různými koncentracemi 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) karbodiimidu (EDC) s N-hydroxysulfosukcinimidem (sulfo-NHS). 12.5% separační gel, barveno Coomassie blue. 1,6 - standardy molekulové hmotnosti LMW Pharmacia, 2-nesesíťovaný 50 M FerB bez přídavku EDC, 3-5 ­ konjugační směsi obsahující 50 M FerB, 5 mM sulfo-NHS a EDC o následujících koncentracích: 3- 500 M,4- 50 mM a 5- 100 mM. Tyto výrazné linie byly vyříznuty z gelu, odbarveny a inkubovány s trypsinem při 37°C po dobu 16h. Tryptické peptidy byly extrahovány z gelu pomocí směsi 50% ACN s 5% kyselinou mravenčí a analyzovány pomocí MALDI-TOF MS a LC-MS/MS (kapalinová chromatografie s hmotnostní detekcí). Zatímco MALDI MS analýza nevedla k identifikaci žádného proteinu, pomocí LC-MS/MS byla získána pozitivní identifikace proteinů ve všech analyzovaných vzorcích (Tab. 4.5). V monomerní linii byla nalezena v obou případech NADPH-dependentní FMN reduktáza o velikosti 20.2 kDa. V obou liniích odpovídajících dvojnásobku velikosti monomeru byla NADPH-dependentní FMN reduktáza pozitivně identifikována společně s dalšími proteiny, jejichž hmotnost odpovídala pozici linie na gelu. 60 M1 1. gi|69933457 Mass: 20208 Score: 155 Queries matched: 5 emPAI: 0.17 NADPH-dependent FMN reductase [Paracoccus denitrificans PD1222] M2 1. gi|69933457 Mass: 20208 Score: 131 Queries matched: 5 NADPH-dependent FMN reductase [Paracoccus denitrificans PD1222] D1 1. gi|119387735 Mass: 40151 Score: 440 Queries matched: 14 Alkanesulfonate monooxygenase [Paracoccus denitrificans PD1222] 2. gi|69933457 Mass: 20208 Score: 177 Queries matched: 8 emPAI: 0.17 NADPH-dependent FMN reductase [Paracoccus denitrificans PD1222] D2 1. gi|119387735 Mass: 40151 Score: 303 Queries matched: 6 Alkanesulfonate monooxygenase [Paracoccus denitrificans PD1222] 2. gi|69936048 Mass: 36107 Score: 194 Queries matched: 6 Thioredoxin reductase [Paracoccus denitrificans PD1222] 3. gi|69933457 Mass: 20208 Score: 131 Queries matched: 5 NADPH-dependent FMN reductase [Paracoccus denitrificans PD1222] Tab. 4.5: Výsledky identifikace proteinů v odpovídajících 1-D liniích pomocí LC-MS/MS analýzy (viz Obr. 4.13). Z porovnání aminokyselinové sekvence identifikovaného proteinu s enzymem FerB vyplývá, že N-terminální část sekvence NADPH-dependentní FMN reduktázy je totožná s FerB 61 s vyjímkou v pozici 18, kde je N místo A, peptid pokrývající tento úsek v sekvenci nebyl pozorován a takto nelze rozhodnout, která z aminokyselin je správně u proteinu ve vzorku. Červeně jsou vyznačeny identifikované úseky sekvence, zeleně je vyznačen peptid, který odpovídá i uvedené části sekvence FerB (obr. 4.14). Velmi pravděpodobně byla tímto existence dimeru FerB prokázána. NADPH-dependent FMN reductase (gi|69933457) MVKTVAVMVGSLRKDSLNHKLMKVLQKLAEGRLEFHLLHIGDLPHYNDDLWADAPESVLRLKDRIEHS DAVLAITPEYNRSYPGMIKNAIDWATRPYGQNSWKGKPAAVIGTSPGVIGAALAQARLKNDLLHVGTV MMSMPEAYIQWHAEAYAADGSVTDEKTAKFLQGFVDAFVDWIEKHG Ferric reductase B (FerB) (gi|62286692) MVKTVAVMVGSLRKDSLAHKLMKVLQK Obr. 4.14: Porovnání aminokyselinové sekvence NADPH-dependentní FMN reduktázy s enzymem FerB. 4.4.3 Další charakterizace FerA a FerB Vysoce purifikované enzymy byly podrobeny SDS-PAGE v 15% polyakrylamidovém gelu a poté přeneseny pomocí Westernblotu na polyvinylidendifluoridovou (PVDF) membránu (BioRad). Z membrány obarvené pomocí Coomassie blue byly vystřiženy zóny odpovídající monomerům FerA a FerB a analyzovány Edmanovou degradací a následnou HPLC analýzou phenylthiohydantoinových derivátů na sekvenátoru (Perkin-Elmer Applied Biosystems). Tímto způsobem byly určeny N-koncové aminokyselinové sekvence FerA a FerB o délce 20 aminokyselinových zbytků pro FerA a 27 aminokyselinových zbytků pro FerB. Porovnáním těchto sekvencí se známými sekvencemi proteinů na serveru BLAST jsme zjistili v případě FerB vysokou podobnost - 73% a 65% (50% identita v obou případech) - s chromanreduktázou Pseudomonas putida, resp. s flavinreduktázou Pseudomonas syringae. Podobnost FerB s chromanreduktázou byla potvrzena schopnosti redukovat za přítomnosti NADH chroman 62 (Mazoch, et al., 2004). N-koncová sekvence enzymu FerA nejeví významnou podobnost s žádnou známou oxidoreduktázou (obr. 4.15). N-terminal sequences: FerA 1 10 20 SRLPP ATRDK LADEI TFFPA FerB 1 10 20 27 MVKTV AVMVG SLRKD SLAHK LMKVL QK (AF375641) chromate reductase [Pseudomonas putida] Length = 186 Score = 27.7 bits (60), Expect = 32 Identities = 13/26 (50%), Positives = 19/26 (73%) Query: 2 VKTVAVMVGSLRKDSLAHKLMKVLQK 27 V +VAV+VGSLRK+S K+ + L + Sbjct: 4 VYSVAVVVGSLRKESYNRKVARALSE 29 Obr. 4.15: N-terminální sekvence Fe(III)-komplex reduktáz bakterie Paracoccus denitrificans (A) a porovnání sekvence FerB se sekvencí chromanreduktázy z Pseudomonas putida (B). Měření absorpčního a fluorescenčního spektra enzymu FerA neprokázala přítomnost chromoforu. Naproti tomu v případě enzymu FerB byly v absorpčním spektru nalezeny absorpční pásy s maximy při 380 nm a 448 nm charakteristické pro přítomnost flavinového kofaktoru, což potvrzovalo také žluté zabarvení roztoku enzymu. Přídavkem 0.4 mM NADH k enzymu FerB docházelo ke zmizení absorpčního maxima při 448 nm (obr. 4.16). 300 350 400 450 500 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 Absorbance Wavelength (nm) Obr. 4.16: Absorpční spektrum FerB (plná čára) a FerB redukovaného NADH (přerušovaná čára). Spektrum FerB (0.2 mg/ml) bylo měřeno za aerobních podmínek v 25 mM Tris/HCl pufru (pH 7.4), jako reference sloužil pufr, optická dráha byla 1 cm. Spektrum redukovaného FerB bylo získáno 5 min po přídavku 0.4 mM NADH. 63 Přítomnost flavinu v proteinu FerB byla potvrzena pomocí fluorescenčních spekter, kde byl roztok enzymu excitován při 446nm a emisní maximum vykazoval při 506nm (obr. 4.17). 300 350 400 450 500 550 0 20 40 60 80 Fluorescenceintensity Wavelength (nm) Obr. 4.17: Fluorescenční spektrum enzymu FerB. Enzym byl excitován při 446 nm (plná čára) a emisní spektrum dosahovalo maxima při 506 nm (přerušovaná čára). O jaký flavin se konkrétně jedná se zjistilo pomocí tenkovrstevné chromatografie. V případě kofaktoru enzymu FerB bylo dosaženo Rf 0.075. Za stejných podmínek byly zjištěny Rf riboflavinu, FMN a FAD a to; 0.40; 0.19; 0.075. Porovnáním hodnot bylo prokázáno, že tímto koenzymem je nekovalentně vázaný FAD (obr. 4.18). Obr. 4.18: Tenkovrstevná chromatografie FerB. Jako standardy byly použity riboflavin (dráha1), FMN (dráha2), FAD (dráha3), drahy 4 a 5 obsahují flavin získaný z enzymu FerB. 64 4.5 Diskuse V této části disertační práce je demonstrována koexistence dvou typů solubilních cytoplasmatických Fe(III) reduktáz (FerA a FerB) bakterie P. denitrificans, které byly purifikovány do homogenity kombinací iontoměničové, chromatofokusační a gelové permeační chromatografie. Tyto dva enzymy byly dále charakterizovány celou řadou biochemických metod. Byla stanovena molekulová hmotnost, isoelektrický bod, koenzymové složení, terminální sekvence a v případě jednoho z nich potvrzena i oligomerní struktura. Oba enzymy se dosti značně liší svými vlastnostmi od dosud známých ferrisideroforreduktáz či flavinreduktáz jiných bakterií. Již během separace na anexu bylo pozorována existence dvou enzymových Fe(III)- reduktázových aktivit, které již zde byly dostatečně odděleny. Chromatofokusace se ukazuje jako účinný purifikační krok, který byl použit opakovaně pro enzym FerB, zatímco v případě FerA byl kvůli jeho vyšší citlivosti ke změnám pH proveden jen jeden chromatofokusační krok. Chromatofokusace posloužila i k určení hodnot pI. Při optimalizaci izolačního postupu FerA a FerB byla úspěšně využita i hydrofobní chromatografie, která se může stát vhodnou alternativou při purifikaci těchto cytoplasmatických enzymů. V případě reduktázy FerA byla pozorována výrazná hydrofobní interakce s matricí. V závěrečném stupni purifikace pomocí GPC byly detekovány pouze jednotlivé píky Fe(III) reduktázové aktivity pro enzymy FerA a FerB a v SDS-PAGE gelu barveného stříbrem byla pozorována pouze jedna dominantní linie obou enzymů. Byla stanovena substrátová specifita FerA a FerB vůči Fe(III)-komplexům, donorům elektronů (NADH nebo NADPH) a s ohledem na nezbytnost přítomnosti FMN (Mazoch et al., 2004). Fe(III)NTA a NADH posloužily jako referenční substráty. Enzym FerA je absolutně závislý na přítomnosti FMN, zatímco aktivita enzymu FerB je v podstatě neměnná při absenci exogenního flavinu. FerB využívá pro svou katalytickou aktivitu jako donory elektronů NADPH stejně jako NADH. Oproti FerB, využívá FerA jako donor elektronů pouze NADH. NADPH nemůže účinně využít. Riboflavin je také dobrým flavinovým kosubstrátem (reakční rychlost činí asi 27% rychlosti reakce s FMN). Patrné jsou rozdíly i v reakcích obou enzymů s Fe(III)-komplexy. FerB dobře redukuje pouze Fe(III)-komplexy s NTA a EGTA a také vykazuje schopnost chinon reduktázy, zatímco FerA redukuje kromě Fe(III)-komplexů s NTA a EGTA i komplexy s o-dihydroxy skupinami, jako jsou maltol, pyrokatechol a 2,3-dihydroxybenzoová kyselina a s vysokou rychlostí také redukuje přírozené katecholické 65 ferrisiderofory syntetizované P. denitrificans (např. parabaktin). Enzym FerA vykazuje významnou NADH:FMN-oxidoreduktázovou aktivitu. V kinetické studii Fe(III) reduktázové reakce katalyzované enzymem FerA byly použity NADH, FMN a Fe(III)NTA jako substráty. Byly získany dvojnásobně reciproké grafy obsahující sadu různoběžných přímek s průsečíkem nalevo od vertikální osy. Ke stejnému výsledku vedla i měření FMN reduktázové reakce FerA. Z těchto kinetických výsledků vyplývá, že enzymová reakce mezi NADH a FMN probíhá sekvenčním mechanismem. Naopak Fe(III) reduktázová reakce katalyzovaná enzymem FerB při variabilních koncentracích NADH a sérii fixních koncentrací Fe(III)NTA poskytla v reciprokém grafu sérii paralelních přímek. Tyto výsledky svědčí o ping-pongovému mechanismu Fe(III) reduktázové reakce FerB (Mazoch et al., 2004). Z uvedených výsledků vyplývá, že oba purifikované enzymy jsou závislé na flavinu. V případě FerA slouží flavin jako disociabilní kosubstrát (flavin reduktázový typ enzymu), zatímco u enzymu FerB je flavin pevně vázaný redoxně aktivní kofaktor (flavoproteinový typ enzymu). Podle toho, zda-li flavin reduktázy využívají jako donory elektronů NADH, NADPH nebo oba NADH i NADPH, lze tyto enzymy roztřídit na D, P a G typ. FerA patří dle této klasifikace k D typu a FerB zřejmě k G typu. Z určené N-koncové aminokyselinové sekvence FerB jsme zjistili vysokou sekvenční podobnost s chromanreduktázou Pseudomonas putida (Park et al., 2000), která byla potvrzena schopnosti redukovat chroman za přítomnosti NADH. Tento enzym byl purifikovan podobně jako FerB kombinací aniontoměničové chromatografie, chromatofokusace a GPC. Rozdíl byl v použití druhu anexu DEAE Sepharose CL-6B, při purifikaci FerB byla využita HP Sepharose Q. Podobnost byla i ve velikosti a podjednotkovém složení. Podjednotka chromanreduktázy měla velikost 20 kDa v SDS-PAGE a velikost celého enzymu určená pomocí GPC (Superose 12) byla 50 kDa. V případě FerB měla podjednotka velikost 18 kDa v SDS-PAGE a 20 kDa zjištěnou pomocí MALDI-TOF. Velikost nativní reduktasy FerB určená pomocí dynamického a statického rozptylu světla a gelové permeační chromatografie dosahovala podobných hodnot v rozmezí 49-55 kDa. Rozdilné byly hodnoty isoelektrických bodů. U chromanreduktázy autoři uvádějí hodnoty pI 7.13 - 7.46 na základě frakcí eluovaných při chromatofokusaci. Izoelektrický bod FerB dosahoval hodnoty 5.5. Oba enzymy využívají jako donory elektronů pro svou katalytickou aktivitu NADPH i NADH. 66 Jistou podobnost jeví enzym FerB i s NAD(P)H-flavin oxidoreduktázou bioluminiscenční bakterie Vibrio fischeri (Inouye, 1994; Koike et al., 1998), která se vyskytuje jako homodimer o srovnatelné velikosti obsahující nekovalentně vázaný FMN jako prostetickou skupinu (v případě FerB se jedná o FAD), využívá NADPH i NADH jako donory elektronů, projevuje ping-pongový kinetický mechanismus a vykazuje podobně jako FerB chinonreduktázovou aktivitu. Enzym FerB nemá přes přítomnost flavinu v aktivním centru enzymu významnou flavinreduktázovou aktivitu. Spektrální vlastnosti FerB a ping-pongový kinetický model naznačují, že enzym v průběhu katalytického cyklu využívá změn oxidačního stavu kofaktoru. Při redukci některých Fe(III) komplexů dobře redukovatelných neenzymově pomocí FMNH2 je FerB poměrně málo účinný, což naznačuje, že zbytek vlastního proteinu významně ovlivňuje substrátovou specifitu (Mazoch, 2004). Toto může být vysvětleno dvěma způsoby. Redoxní páry Fe(III)/Fe(II) komplexů s maltolem, pyrokatecholem a 2,3-dihydroxybenzoátem, které přijímají elektrony od FerB velmi špatně nebo vůbec, mají velmi nízké hodnoty standardního redoxního potenciálu (Rozkošná 2003), tudíž redukovaný kofaktor FerB nemůže předat elektrony těmto substrátům. Druhou možností se jeví poměrně hluboké uložení dutiny pro vazbu substrátu s rozměry umožňujícími vstup pouze menším akceptorům elektronů, např. Fe(III)-komplexy s poměrem Fe(III):ligand 1:1, chromanu a chinonům, avšak již ne v případě objemnějších komplexů s poměrem Fe(III):ligand 1:3 nebo exogenních volných flavinů (Mazoch et al., 2004). N-koncová sekvence enzymu FerA nejeví významnou podobnost s žádnou známou oxidoreduktázou. Měřením absorpčního a fluorescenčního spektra enzymu FerA nebyla prokázána přítomnost kofaktoru v tomto enzymu. Nepřítomnosti kofaktoru, velikostí a výskytem v monomerní formě, substrátovou specifitou a kinetickým mechanismem se podobá NAD(P)H:flavin oxidoreduktáze z Vibrio harveyi (Jablonski and DeLuca 1978; Michaliszyn et al., 1977). Molekulová hmotnost této reduktázy byla 24 kDa určená pomocí SDS-PAGE i GPC, z čehož vyplývá výskyt NAD(P)H:flavin oxidoreduktázy jako monomeru. Kinetické studie ukazují vyšší specifitu pro NADH jako donora elektronů a enzymová reakce mezi NADH a FMN probíhá sekvenčním mechanismem jako v případě FerA. Oba enzymy produkují redukovaný flavin, který v případě FerA slouží jako redukční činidlo pro Fe(III)-komplexy a v případě oxidoreduktázy z Vibrio harveyi se účastní bioluminiscenční reakce bakterie. 67 5. Analýza proteinů hyfového a sporového antigenu kožní houby Trichophyton verrucosum. 5.1. Úvod Trichofytóza je houbové onemocnění neživých zrohovatělých keratinizovaných tkání napadající kůži, vlasy nebo nehty zvířat s možným přenosem i na člověka. Bovinní trichofytóza je onemocnění způsobené dermatofytem Trichophyton verrucosum. Vysoké rozšíření choroby v minulých letech vedla ke studiu imunitní odpovědi hostitele k dermatofytům a k vývoji efektivních vakcín. Vakcinační programy, započaté poprvé v bývalém Sovětském Svazu v roce 1969, úspěšně eliminovaly bovinní trichofytózu v mnoha zemích se současným poklesem této infekce u lidí (Mackenzie et al., 1986). Od poloviny šedesátých let se začaly provádět experimentální imunizace původcem trichofytózy (Florian et al., 1964; Sarkisov et al., 1971). Z imunologického hlediska jsou v buněčné stěně dermatofytů obsaženy zejména glukany a glykoproteiny. Mezi důležité exoprodukty těchto hub patří enzymy keratinázy umožňující kožní invazi parazita, které jsou spolu s glykoproteiny považovány za hlavní skupinu dermatofytických antigenů. Polysacharidová část glykopeptidu je zodpovědná za humorální imunitu, zatímco proteinová část přednostně stimuluje buněčně zprostředkovanou imunitu (Weitzman et al., 1995). Ta je zásadní pro překonání kožního onemocnění (Jones et al., 1974) a také pro ochranu proti infekci (Woodfolk et al., 1998; Smith et al., 1995; Hanifin et al., 1974; Helander, 1975). Tento typ imunity je zajišťován Th1 typem imunitní odpovědi (Koga et al., 1992; Fong and Mosmann, 1989). Tvorba specifických protilátek proti dermatofytním antigenům byla rovněž popsána (Koga et al., 1993), nicméně, jejich role v ochraně proti infekci, není považována za významnou. 5.2 Trichofytóza 5.2.1 Trichophyton verrucosum Původcem trichofytózy jsou vláknité houby (plísně) zařazené do podkmene Mycomycetes, třídy Deuteromycetes, čeledi Dermatophytacae, rodu Trichophyton. Zástupci čeledi Dermatophytacae jsou kromě saprofytického života schopni parazitovat na kůži a kožních 68 derivátech. Pro jejich život je esenciální keratin jako nutriční zdroj (Sohnle et al., 1993). Trichophyton verrucosum je patogenní primárně pro skot, ale může se vyskytovat také u prasat, koní, ovcí, koz, psů, koček, a také i u člověka. 5.2.2 Patogeneze Původci onemocnění svými enzymy rozkládají zrohovatělou epidermis, chlupy, peří, popřípadě drápy, tzn. části obsahující keratin. Trichofytóza je charakterizována vznikem mnohačetných mokvavých ložisek na kůži, pokrytých později šupinami nebo souvislou silnou krustou s výrazně patrnou zánětlivou reakcí kůže. Trichofytická ložiska obsahují velmi velké množství spor původce, postižená zvířata proto mohou být stálým zdrojem infekce pro své okolí. 5.3 Cíl práce Účinnost vakcíny proti trichofytóze byla zatím hodnocena na základě čelenžních testů na experimentálně infikovaných telatech (Rybníkař et al., 1987). Laboratorní testy které již dříve byly použity pro potvrzení role buňkami zprostředkované imunity (CMI) v ochraně proti trichofytóze nebyly zatím dostatečně validovány (Lund et al., 2001). Z tohoto důvodu naše pracoviště ve spolupráci s výrobcem vakcíny proti trichofytóze Biovetou a.s., Ivanovice na Hané se pokusilo hodnotit úroveň specifické imunity na základě laboratorních testů a korelovat je s výsledky čelenžních infekcí. Pro vlastní testy jsme použili dva druhy antigenů, a to vláknitý hyfový (AgH) a sporový (AgS). Jedním z cílů mé práce byla proteinová analýza jejich složek pomocí SDS-PAGE a zjištění molekulární hmotnosti proteinů, které jsou zodpovědné za jejich specifické imunitní reakce. 5.4 Souhrn výsledků 5.4.1 Příprava a charakterizace antigenů AgS a AgH Antigeny byly připraveny z buněk Trichophyton verrucosum CCM F-765. Kmen byl kultivován po dobu 15 dnů při teplotě 26 °C na pevných médiích (v případě antigenu AgH na Sabouraudově agaru, v případě antigenu AgS na sladinkovém agaru). Kultura byla homogenizována v 0,8 % roztoku NaCl, lyofilizována a potom inaktivována zářením. 69 Během výroby antigenu AgS bylo před lyofilizací suspenze kultury provedeno odstranění hyf ze suspenze opakovanou filtrací. 5.4.2 Stanovení koncentrace bílkovin ve vzorku Byla zjištěna koncentrace bílkovin pomocí BCATM kitu v AgH a AgS po odstředění, a to u AgH dosahoval hodnoty 0.6 mg/ml a u AgS hodnoty 0.8 mg/ml. 5.4.3 Analýza proteinové složky pomocí SDS-PAGE Pomocí elektroforézy v 12.5% polyakrylamidovém gelu SDS-PAGE byly analyzovány proteinové subjednotky AgH a AgS. Barvení pomocí Commassie Blue se neosvedčilo; špatné barvení jednotlivých glykoproteinů bylo pravděpodobně způsobené tím, že proteinové složky v obou antigenech tvořily, oproti složce sacharidové, jen malý podíl. Z tohoto důvodu jsme použili citlivější barvení pomocí amoniakálního roztoku stříbra. Sporový antigen AgS musel být navíc zakoncentrován centrifugační ultrafiltrací, aby mohl být dávkován do jamek zaostřovacího gelu ve větším množství než antigen hyfový AgH, a to i přesto, že koncentrace bílkovin v AgS byla vyšší než v AgH. I přes tyto opatření byly jednotlivé linie AgS méně výrazné než v případě AgH. Z elektroforetogramu (Obr. 5.1) bylo patrné, že AgH antigen se rozdělil do 13 frakcí polypeptidů o molekulové hmotnosti cca od 33 do 114 kDa, v případě AgS do 10 linií přibližně stejného velikostního rozsahu. Hyfový antigen AgH se odlišoval od sporového AgS čtyřmi liniemi polypeptidů s molekulovou hmotností cca 98-100 kDa, 68-69 kDa, 55-56 kDa, 35-36 kDa. Sporový antigen AgS se odlišoval od AgH jednou méně výraznou linií o molekulové hmotnosti kolem 53-54 kDa. 70 marker AgS AgH 98-100 68-69 55-56 kDa 35-36 53-54 Obr. 5.1: SDS-PAGE trychofytických AgS a AgH antigenů - barveno stříbrem (standardy molekulové hmotnosti ­ Low Range Bio-Rad, 20 l AgS ­ 4x zakoncentrovaný, 15 l AgH ). 5.4.4 Zjištění velikostí proteinů zodpovědných za specifickou imunitní reakci pomocí imunoblotu Specifita trychofytických AgH a AgS polypeptidů byla ověřena přenosem rozdělených zón z polyakrylamidových gelů na nitrocelulózovou membránu a následnou detekcí pomocí pozitivního bovinního séra získaného vakcinací krav komerční vakcínou (Trichoben, Bioveta). Sérum mělo vysoké titry protilátek jak proti AgH tak i proti AgS; potvrzené ELISA metodou. Specifické linie byly vizualizovány použitím sekundární kozí protilátky proti hovězímu IgG (Jackson, USA). Optimální ředění specifického bovinního séra bylo 1:300 v případě AgS a 1:200 u AgH. Kozí konjugát byl použit v ředění 1:300 pro oba antigeny. Přenesené proteiny sporového antigenu AgS, byly, ve srovnání s hyfovým antigenem AgH, opět méně výrazné. Rozsah specifických proteinových linií u obou antigenů, které reagovaly s pozitivním sérem imunizovaných telat, byl poměrně široký. Při kontrolní reakci s negativním sérem nebyla pozorována žádná viditelná reakce. Metodou imunoblotu (Obr. 5.2) bylo zjištěno, že ze spektra polypeptidů AgH antigenu s pozitivním bovinním sérem reagovalo 5 proteinů v rozmezí velikostí cca od 40 do 90 kDa. Čtyři z nich byly totožné s liniemi AgS; jejich velikost byla: 87-90 kDa, 70-75 kDa, 51 kDa, 71 44-45 kDa. AgS antigen se rozdělil v 6 specifických polypeptidových linií v rozsahu molekulových hmotností cca od 40 do 118 kDa. Sporový antigen AgS se odlišoval od hyfového AgH dvěmi specifickými nezřetelnými liniemi s molekulovou hmotností okolo 111117 kDa a 63-65 kDa. AgH se lišil od AgS specifickou méně výraznou linií v oblasti 76-80 kDa. Obr. 5.2: Imunoblot separovaných trychofytických AgS a AgH antigenů (standardy molekulové hmotnosti - Low Range Bio-Rad, 30 l AgS ­ 5,5x koncentrovaný, 20 l AgH, primární bovinní protilátka ­ ředění 300x (AgS), 200x (AgH), kozí konjugát ­ ředění 300x pro oba antigeny). 5.5 Diskuse Použití elektroforézy SDS-PAGE mělo za cíl zjistit proteinové spektrum hyfového AgH a sporového AgS antigenů a jejich vzájemným porovnáním zjistit případnou rozdílnost ve složení proteinů rozdělených podle molekulové hmotnosti. Imunoblot měl následně ukázat, které proteiny jsou zodpovědné za tvorbu specifických protilátek. Z tohoto pohledu splnila SDS-PAGE svůj význam, i když vyhodnocení špatně barvitelného obrazu elektroforetogramu bylo obtížné. Pomocí SDS-PAGE byla prokázána přítomnost 13 polypeptidových linií v případě AgH a 10 polypeptidových linií v případě AgS přibližně stejného velikostního rozsahu. Porovnáním proteinového spektra hyfového AgH antigenu se sporovým AgS antigenem byly nalezeny rozdíly ve čtyřech polypeptidových liniích, naproti tomu se AgS lišil ve srovnání s AgH antigenem v jedné proteinové linií. Imunoblotem byla prokázána specifická reakce s pozitivním hyperimunním sérem s 5 specifickými liniemi v případě AgH a se 6 polypeptidovými liniemi v případě AgS. Čtyři 72 proteiny o velikosti 87-90 kDa, 70-75 kDa, 51 kDa, 44-45 kDa vykazovaly specifickou reakci u obou typů antigenů. Rozdíly byly pozorovány výskytem nezřetelných proteinových linií o velikosti 111-117 kDa a 63-65 kDa u sporového antigenu AgS a méně výraznou specifickou linií v oblasti 76-80 kDa u hyfového antigenu AgH. Vysoká homologie obou antigenů je dána jejich přípravou, která je neumožnila zcela oddělit. V případě použité separační techniky bychom měli spíše hovořit o antigenech s "převahou hyfové nebo sporové složky". Kromě toho je obtížné srovnat námi použité antigeny s těmi, které použili ostatní autoři. Často se liší jak přípravou, tak i složením. Nebývají také dobře charakterizovány a z tohoto důvodu jsou často používány rozdílné antigeny. Proto se také tato práce snaží o přesnější charakteristiku použitých antigenů. Oba antigeny vykazují stejné dominantní proteiny a liší se pouze v minoritních frakcích. Nicméně drobné rozdíly v jejich proteinovém spektru mohou být příčinou relativně významných odlišností v imunitních reakcích a to jak humorálních, tak i buněčných (Faldyna et al., 2007). Metoda imunoblotu byla již dříve užita k charakteristice houbových antigenů použitých pro hodnocení protilátkové imunitní odpovědi u koček infikovaných Microsporum canis (Sparkes et al., 1994) a králíků infikovaných Trichophyton mentagrophytes (Zrimsek et al., 1999). Dále byly popsány extrakce antigenních materiálů z dermatofytů, použité k vyšetření protilátkové imunitní odpovědi infikovaných lidí (Jones, 1993), koček (de Boer and Moriello, 1993), morčat a králíků (Pier et al., 1995) a myší (Pinter et al., 1995). Výsledkem předložených analýz je charakterizace obou antigenů použitých k testům buněčné imunity. Popsaný postup umožní srovnat použité antigeny a tím standardizovat doporučené postupy funkčních testů. 73 6. Závěry 1. Nukleokapsidové proteiny N viru reprodukčního a respiračního syndromu prasat (PRRSV) evropského a severoamerického sérotypu byly připraveny v eukaryotním bakulovirovém systému genové exprese. Produkce a identita obou rekombinantních nukleokapsidových N proteinů byly prokázány pomocí SDS-PAGE. Jejich specifita v rekombinantních bakulovirech byla ověřena technikou imunoblotu pomocí positivních prasečích sér obsahujících protilátky proti oběma sérotypům a v případě amerického sérotypu monoklonální protilátkou. Exprimované proteiny N obou sérotypů byly izolovány z lyzátu hmyzích buněk pomocí preparativní elektro-eluční SDS-PAGE na zařízení Prep Cell Model 491 (Bio-Rad) ve spojení se systémem FPLC (Pharmacia). Koncentrace purifikovaných proteinů N v získaných frakcích, které byly následně analyzovány pomocí SDS-PAGE a imunoblotu, dosahovala hodnot v rozmezí 80 - 250 g/ml. Celkový výtěžek dosahoval 1 mg během jednoho běhu purifikace při zachování čistoty přes 95%. Frakce obsahující čistý nukleokapsidový protein N byly sloučeny a použity jako antigeny k sestavení diagnostického nepřímého ELISA testu k průkazu PRRSV protilátek v sérech prasat. Porovnáním tohoto ELISA testu se standardní diagnostickou soupravou IDEXX HerdCheck ELISA na souboru 552 sér prasat byla stanovena citlivost 98.3 % a specifita 92.6 %. 2. Z anaerobně kultivovaného kmene Pd2121 defektního v cytochromu c550 byl purifikován kombinací iontoměničové (Sepharose Q, mono Q) chromatografie a gelové permeační chromatografie (Superose 12) periplasmatický protein schopný přenášet elektrony z cytoplasmatické membrány na periplasmatickou nitritreduktázu. Pomocí SDS-PAGE byla potvrzena čistota izolovaného proteinu a stanovena molekulová hmotnost 14 kDa. Stejná velikost byla prokázána použitím analytické GPC na koloně Superose 12, která zároveň potvrdila výskyt tohoto proteinu v nativním stavu v monomerní formě. Použitím několika dalších nezávislých charakteristik (obsah mědi, spektrum ve viditelné oblasti, N-terminální aminokyselinová sekvence) bylo dokázáno, že purifikovaným proteinem je pseudoazurin. Výsledky byly publikovány. 74 3. Dva rozpustné cytoplasmatické enzymy (FerA a FerB) bakterie P. denitrificans s Fe(III) reduktázovou aktivitou byly purifikovány do vysokého stupně čistoty kombinací aniontoměničové chromatografie (Sepharose Q), chromatofokusace (Mono P) a gelové permeační chromatografie (Superose 12). Stupeň přečištění dosahoval v případě FerA 1424 a v případě FerB 568. Při optimalizaci izolačního postupu FerA a FerB byla úspěšně využita i hydrofobní chromatografie, která se může stát vhodnou alternativou při purifikaci těchto cytoplasmatických enzymů. Při chromatofokusaci jsme určili pH odpovídající isoelektrickým bodům obou enzymů: pro FerA bylo určeno pI 6.9 a pro FerB dosahovalo pI 5.5. SDS-PAGE určila molekulové hmotnosti monomerů FerA i FerB cca 18 kDa. Pomocí MS-MALDI-TOF byly molekulové hmotnosti monomerů upřesněny - pro FerA byla zjištěna výsledná molekulová hmotnost 18.8 kDa - 18.9 kDa, pro FerB molekulová hmotnost monomeru činila 20.2 kDa. Gelová permeační chromatografie na analytické koloně Superose 12 nám posloužila k určení nativní molekulové hmotnosti obou enzymů, která byla odhadnuta na 20 kDa pro FerA a 52 kDa pro FerB. Oligomerní struktura FerB byla potvrzena měřením velikosti částice nativního ezymu pomocí dynamického rozptylu světla (DLS) a dosahovala hodnoty 49 kDa. Molekulová hmotnost FerB měřená pomocí statického rozptylu světla (SLS) byla vypočítána na hodnotu 55 kDa. Z těchto výsledků se dalo usuzovat na výskyt FerB jako homodimeru. K průkazu oligomerní struktury FerB byla využita metoda síťování pomocí 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (EDC) s N-hydroxysulfosukcinimidem (sulfo-NHS). Shrnuto - FerA je monomer o molekulové hmotnosti 19 kDa, zatímco nativní FerB vykazuje velikost cca 50 kDa a je tvořen ze dvou stejných podjednotek o velikosti 20 kDa. Byly určeny N-koncové aminokyselinové sekvence o délce 20 aminokyselinových zbytků pro FerA a 27 aminokyselinových zbytků pro FerB. Porovnáním těchto sekvencí se známými sekvencemi proteinů na serveru BLAST jsme zjistili v případě FerB vysokou podobnost- 73% a 65% (50% identita v obou případech) - s chromanreduktázou Pseudomonas putida, resp. s flavinreduktázou Pseudomonas syringae. N-koncová sekvence enzymu FerA nejeví významnou podobnost s žádnou známou oxidoreduktázou. Měření absorpčního a fluorescenčního spektra enzymu FerA neprokázala přítomnost chromoforu. Naproti tomu v případě enzymu FerB byla v absorpčním a fluorescenčním 75 spektru potvzena přítomnost flavinového kofaktoru. Pomocí tenkovrstevné chromatografie bylo určeno, že koenzymem je nekovalentně vázaný FAD. FerA může být klasifikován jako NADH:flavin oxidoreduktáza se sekvenčním reakčním mechanismem a vyžaduje pro svoji Fe(III) reduktázovou aktivitu přítomnost flavinu jako disociabilního kosubstrátu. Purifikovaný FerB může využít NADPH místo NADH, neredukuje volný flavin a vykazuje ping-pongový kinetický model se substráty NADH a Fe(III)-NTA. Výsledky byly publikovány. 4. Byla provedena proteinová analýza hyfového a sporového antigenu patogenní houby Trichofyton verrucosum pomocí SDS-PAGE. Imunoblotem byla charakterizována molekulová hmotnost proteinů, které jsou zodpovědné za jejich specifickou imunitní reakci. Oba antigeny AgH a AgS vykazovaly stejné dominantní proteiny, nicméně ale drobné rozdíly v jejich proteinovém spektru mohou být příčinou relativně významných odlišností v imunitních reakcích a to jak humorálních, tak i buněčných. Výsledky byly součástí publikace. 76 7. Seznam použitých zkratek AcMNPV Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus ACN acetonitril ADH alkoholdehydrogenáza AgH hyfový antigen kožní houby Trichophyton verrucosum AgS sporový antigen kožní houby Trichophyton verrucosum Bac-N-Blue modifikovaná linearizovaná bakulovirová DNA BCA bicinchoninic acid BLAST program pro srovnávání sekvencí (basic local alignment search tool) bp pár bází (base pair) BV pučící viriony (budded virus) CAPM Sbírka zoopatogenních mikroorganismů (Collection of Animal Pathogenic Microorganisms) CMI buňkami zprostředkovaná imunita (cell mediated immunity) cycA strukturní gen cytochromu c550 DDC dietyldithiokarbamát DLS dynamický rozptyl světla (Dynamic light scattering) DNA deoxyribonukleová kyselina dpi dny po infekci E. coli Escherichia coli EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid EDTA ethylendiamintetraacetát EGTA ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetát ELISA enzymo-imuno analýza (enzyme linked immunosorbent assay) EMEM Eaglés minimální esenciální médium 77 EU evropský sérotyp FerA, FerB Fe(III)-komplex reduktáza = NAD(P)H:Fe(III)-komplex oxidoreduktáza Ferrozin 3-(2-pyridyl)-5,6-difenyl-1,2,4-triazin-4',4''-disulfonát FnrP transkripční faktor kontrolující expresi denitrifikačních enzymů u P. denitrificans FPLC fast protein liquid chromatography Fre flavin reduktáza = NAD(P)H:flavin-oxidoreduktáza Fsr Ferrisideroforreduktáza = NAD(P)H:Fe(III)-siderofor-oxidoreduktáza GenBank nukleotidová databáze (National Center for Biotechnology Information) GP glykoprotein GPC gelová permeační chromatografie GV Granulovirus HMP protein podobný hemoglobinu (E. coli) s Fe(III)-reduktázovou a flavinreduktázovou aktivitou IFA imunofluorescenční test (immunofluorescence assay) Ig imunoglobulin IPMA imunoperoxidázový monolayerový test (immunoperoxidase monolayer assay) ISH in situ hybridizace kb tisíc párů bází (kilobase pairs) kDa kilodalton, jednotka molekulové hmotnosti biomolekul KM Michaelisova konstanta lacZ gen E. coli kódující ß-galaktozidázu LV Lelystad virus, referenční kmen PRRSV MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za pomoci matrice v kombinaci s detektorem doby letu (matrix-assisted laser desorption/ionisation - time-of-flight mass spectrometry) Maltol 3-hydroxy-2-methyl-4-pyron 78 MARC buněčná linie buněk pocházející ze zárodečných opičích ledvin MNPV multiple nucleopolyhedrovirus NA severoamerický sérotyp NCBI National Center for Biotechnology Information nELISA nepřímá enzymo-imuno analýza NPV Nukleopolyhedrovirus NTA nitrilotriacetát, kyselina nitrilotrioctová occfenotyp netvořící okluze, rekombinantní bakulovirus occ+ fenotypový projev okluzí ODV occlusion derived virus ORF otevřený čtecí rámec (open reading frame) pBlueBac plazmid E. coli, transferový vektor PCR polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction) P.denitrificans Paracoccus denitrificans PFU koncentrace virových částic (plaque forming units) PRRS reprodukční a respirační syndrom prasat PRRSV virus reprodukčního a respiračního syndromu prasat qRT-PCR kvantitativní reverzní transkripce s polymerázovou řetězovou reakcí (v reálném čase) rBac rekombinantní bakulovirus RNA ribonukleová kyselina RT-PCR reverzní transkripce s polymerázovou řetězovou reakcí (reverse transcriptionpolymerase chain reaction) SDS-PAGE elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným Sf-9 buněčná kultura hmyzích buněk odvozených od druhu Spodoptera frugiperda SLS statický rozptyl světla (static light scattering) SNPV single nucleopolyhedrovirus 79 ss jednořetězcový (single stranded) sulfo-NHS N-hydroxysulfosukcinimid X-Gal 5-brom-4-chlor-3-indoxyl--D-galaktosid 80 8. Seznam použité literatury Albina, E., Leforban, Y., Baron, T., Plana Duran, J., Vannier, P. (1992) Ann Rech Vet. 23: 167-176. Allen, R.C., Budowle, B. (1994) Gel Electrophoresis of Proteins and Nucleic Acids: Selected Techniques. de Gruyter, Berlin. Alwine, J.C., Kemp, D.J., Stark, G.R. (1977) Proc Natl Acad Sci USA. 74: 5350-4. Andrews, S.C., Shipley, D., Keen, J.N., Findlay, J.B., Harrison, P.M., Guest, J.R. (1992) FEBS Lett. 302: 247-252. Arai, H., Igarashi, Y., Kodaky, T. (1995) Biochim Biophys Acta. 1261: 279-284. Arceneaux, J.E., Byers, B.R. (1980) J Bacteriol. 141: 715-721. Ayres, M.D., Howard, S.C., Kuzio, J.A., Polez-Ferber, M., Possee, R.D. (1994) Virology. 202: 586-605. Baldo,B.A., Tovey, E.R. (1989) Protein Blotting: Methodology, Research and Diagnostic Applications. Karger, Basel. Ballard, A.L., Ferguson, S.J. (1988) Eur J Biochem. 174: 207-212. Baker, S.C., Ferguson, S.J., Ludwig, B., Page, M.D., Richter, O.M.H., van Spanning, R.J.M. (1998) Microb Mol Biol Rev. 62: 1046-1078. Benfield, D.A., Nelson, E., Collins, J.E., Harris, L., Goyal, S.M., Robison, D., Christianson, W.T., Morrison, R.B., Gorcyca, D., Chladek, D. (1992) J Vet Diagn Invest. 4: 127- 133. Bennett, B., Charnock, J.M. Sears, H.J. Berks, B.C. Thomson, A.J. Ferguson, S.J., Garner, C.D., Richardson, D.J. (1996) Biochem J. 317: 557-563. Bergman, A. C., Benjamin, T., Alaiya, A., Waltham, M., Sakaguchi, K., Franzen, B., Linder, S., Bergman, T., Auer, G., Appella, E., Wirth, P. J., Jornvall H. (2000) Electrophoresis. 21: 679-86. Berks, B.C., Richardson, D.J., Robinson, C., Reilly, A., Aplin R.T., Ferguson, S.J. (1994) Eur J Biochem. 220: 117-124. Bers,G., Garfin, D. (1985) Bio Techniques. 3: 276-88. 81 Bjerrum, O.J., Heegaard, N.H.H. (1988) CRC Handbook of Immunoblotting of Proteins, Vol. 1 and 2. CRC Press, Boca Raton, FL. Breton, J., Berks, B.C., Reilly, A.,Thomson, A.J.,Ferguson, S.J., Richardson D.J. (1994) FEBS Lett. 345: 76-80. Brown, K., Djinovic-Carugo, K., Haltia, T., Cabrito, I., Saraste, M., Moura, J. J. G., Moura, I., Tegoni, M., Cambillau, C. (2000a) J Biol Chem. 275: 41133-41136. Brown, K., Tegoni, M., Prudencio, M., Pereira, A.S., Besson, S., Moura, J.J.G., Moura, I., Cambillau, C. (2000b) Nature Struct Biol. 7: 191-195. Brown, K.A., Ratledge, C. (1975) FEBS Lett. 53: 262-266. Butler, C.S., Charnock, J.M., Bennett, B., Sears, H.J., Reilly, A.J., Ferguson, S.J., Garner, C.D., Lowe, D.J., Thomson, A.J., Berks, B.C., Richardson D.J. (1999) Biochemistry. 38: 9000-9012. Carr, G.J., Ferguson, S.J. (1990) Biochem J. 269: 423-429. Carraway, K.L., Triplett,R.B. (1970) Biochim Biophys Acta. 200: 564-566. Conzelmann, K.K., Visser, N., Van Woensel, P., Thiel, H.J. (1993) Virology. 193: 329-39. Coves, J., Eschenbrenner, M., Fontecave, M. (1993a) Biochem Biophys Res Commun. 3: 1403-1408. Coves, J., Fontecave, M. (1993) Eur J Biochem. 211: 635-641. Coves, J., Nivire, V., Eschenbrenner, M., Fontecave, M. (1993b) J Biol Chem. 268: 18604- 18609. Cowart, R.E. (2002) Arch Biochem Biophys. 400: 273­281. Dailey, H.A., Lascelles, J. (1977) J Bacteriol. 129: 815-820. Davis, B.J. (1964) Ann N Y Acad Sci. 121: 404-27. Dea, S., Wilson, L., Therrien, D., Cornaglia, E. (2000) J virol. Met. 87: 109-122. de Boer, A.P.N., Reijnders, W.N.M., Kuenen, J.G., Stouthamer, A.H., van Spanning, R.J.M. (1994) Antonie Van Leeuwenhoek. 66: 111-127. de Boer, A.P.N., van der Oost, J., Reijnders, W.N.M., Westerhoff, H.V., Stouthamer, A.H., van Spanning, R.J.M. (1996) Eur J Biochem. 242: 592-600. 82 de Boer, D.J., Moriello, K. A. (1993) J Med Vet Mycol. 31: 121-32. Denac, H., Moser, C., Tratschin, J.D., Hofmann, M.A. (1997) J virol Met. 65: 169-181. Dobbin, P.S., Warren, L.H., Cook, N.J., McEwan, A.G., Powell, A.K., Richardson, D.J. (1996) Microbiology. 142: 765­774. Einarsdottir IE, Anjos L, Hildahl J, Bjornsson BT, Power DM. (2007) Gen Comp Endocrinol. 150: 355-63. Faaberg, K.S., Even, C., Palmer, G.A., Plagemann, P.G. (1995) J Virol. 69: 613-617. Fagerstam, L.G., Pettersson G.L. (1979) FEBS Lett. 98: 363-7. Fagerstam, L.G., Lizana, J., Axiö-Fredriksson, U.B., Wahlström, L. (1983) J Chromatogr. 266: 523-32. Faldyna, M., Oborilova E., Krejci J., Tesarik R., Krejci E., Pavlova B., Rybnikar A. (2007) Vaccine. 25: 7948-54. Fauquet, C.M., Mayo, M.A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L.A. (2005) Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses. Elsevier Academic Press. Florian, E., Nemesori, L., Louas, G. (1964) Mag Allatory Lap. 19: 529-30. Fong, T.A.T., Mosmann, T.R. (1989) J Immunol. 143: 2887-2893. Fontecave, M., Eliasson, R., Reichard, P. (1987) J Biol Chem. 262: 12325-12331. Foret, F., Bocek, P. (1989) Adv Electrophor. 3: 271-347. Gaines, C.G., Lodge, J.S., Arceneaux, J.E.L., Byers, B.R. (1981) J Bacteriol. 148: 527-533. Galuszka P, Frébort I, Sebela M, Sauer P, Jacobsen S, Pec P. (2001) Eur J Biochem. 268:450- 61. Gershoni, J.M. (1987) Adv Electrophor. 1: 141-75 Goyal, S.M. (1993) J Vet Diagn Invest. 5: 656-664. Grebennikova, T.V., Alekseev, K.P., Gibadulin, R.A., Musienko, M.I., Tsybezov, V.V., Bogdanova, V.S., Zaberezhnyi, A.D., Aliper, T.I, Nepoklonov, E.A. (2004) Vopr Virusol. 49:37-42. Halle, F., Meyer, J.M. (1989) Biol Met. 2: 18-24. Halle, F., Meyer, J.M. (1992a) Eur J Biochem. 209: 613-620. 83 Halle, F., Meyer, J.M. (1992b) Eur J Biochem. 209: 621-627. Hallin, S., Lindgren, P.E. (1999) Appl Environ Microbiol. 65: 1652-1657. Hanash S. M. (2000) Electrophoresis. 21: 1202-9. Hanifin, J. M., Ray, L. F., Lobitz, W. C., Jr. (1974) Br J Dermatol. 90: 1. Harrap K. (1972b) Virology. 50: 124-32. Helander, I. (1975) Cell-mediated Immunity in Dermatophytosis. Thesis, Turku, Finland. Hermanson, G.T. (1996) Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego. Hjerten, S. (1963) J Chromatogr. 12: 510-26. Hoare, D.G., Koshland, D.E. (1967) J Biol Chem. 242: 2447-2453. Huyer, M., Page, W.J. (1989) J Bacteriol. 171: 4031-4037. Cho, H.J., Deregt, D., Joo, H.S. (1996) Can J Vet Res. 60: 89-93. Inouye, S. (1994) FEBS Lett. 347: 163­168. Jablonski, E., de Luca, M. (1978) Biochemistry. 17: 672­678. Jeppson, J.O., Kallman, I., Lindgren, G., Fägerstam, L.G. (1984) J Chromatogr. 297: 31-36. Johnson, W., Varner, L., Poch, M. (1991) Infect Immun. 59: 2376-2381. Jones, H.E. (1993) J Am Acad. Dermatol. 28: S12-S18. Jones, H.E., Reinhardt, J.H., Rinaldi, M.G. (1974) Arch Dermatol. 109: 840-848. Keffaber, K.K. (1989) Am Assoc Swine Pract Newsletter. 1: 1-10. Kim, H.S., Kwang, J., Yoon, I.J., Joo, H.S., Frey, M.L. (1993) Arch Virol. 133: 477-483. Kitts, P. A., Possee, R. D. (1993) Biotechniques. 14: 810-817. Koga, T., Ishizaki, H., Matsumoto, T., Hori, Y. (1993) Journal of Dermatology. 20: 441-443. Koga, T., Matsuda, T., Hori, Y., Ishizaki, H., Matsumoto, T. (1992) Jpn J Med Mycol. 33: 521-524. Koike, H., Sasaki, H., Kobori, T., Zenno, S., Saigo, K., Murphy, M.E.P., Adman, E.T., Tanokura, M. (1998) J Mol Biol. 280: 259­273. Kosinová, E. (2007) Disertační práce - Exprese strukturálních proteinů živočišných virů v eukaryotních systémech. 84 Koutný, M., Kučera, I., Tesařík, R., Turánek, J., van Spanning, R.J.M. (1999) FEBS Lett. 448: 157-159. Koutný, M. (1999) Disertační práce-Přenos elektronů v periplasmě bakterie Paracoccus denitrificans. Kreutz, L.C., Mengeling, W.L. (1997) Vet Microbiol. 59: 1-13. Kučera, I., Maťchová, I. (1997) Biochem. Mol Biol Int. 43: 305-310. Laemmli, U.K. (1970) Nature. 227: 680-5. La Foue, A.E., Morse, S.A. (1991) Biol Met. 4: 126-131. Lascelles, J., Burke, K.A. (1978) J Bacteriol. 134: 585-589. Leung, Y.C., Chan, C., Reader, J.S., Willis, A.C., van Spanning, R.J., Ferguson, S.J., Radford, S.E. (1997) Biochem J. 321: 699-705. Lewis, J.K., Wei, J., Siuzdak, G. (2000) Encyclopedia of Analytical Chemistry. 5880­5894 Liu, M.Y., Liu, M.C., Payne, W.J., LeGall, J. (1986) J Bacteriol. 166: 604-608. Lodge, J.S., Gaines, C.G., Arceneaux, J.E.L. (1982) J Bacteriol. 149: 771-774. Loemba, H.D., Mounir, S., Mardassi, H., Archambault, D., Dea, S. (1996) Arch Virol. 141: 751-761. Lund, A., Bratberg, A. M., Solbakk, I. T. (2001) Veterinary Dermatology. 12: 75-80. Mackenzie, D.W.R., Loeffler, W., Mantovani, A., Fujikura, T. (1986) Guidelines for the Diagnosis, Prevention and Control of Dermatophytosis in Man and Animals, pp. 5563. World Health Organization, Geneva. [WHO/CDS/VPH/86.67]. Madden, J.F., Han, S.H., Siegel, L.M., Spiro, T.G. (1989) Biochemistry. 28: 5471-5477. Mandal M, Mandal A, Das S, Chakraborti T, Chakraborti S. (2003) Mol Cell Biochem. 254: 275-87. Mardassi, H., Mounir, S., Dea, S. (1994) J G Virol. 75: 681-685. Mardassi, H., Mounir, S., Dea, S. (1995) Arch Virol. 140: 1405-1418. Mardassi, H., Massie, B., Dea, S. (1996) Virology. 221: 98-112. Martin, A.J., Synge, R.L. (1941) Biochem J. 35: 91-121. Maťchová, I., Kučera, I. (1991) Biochim Biophys Acta. 1058: 256-260. 85 Maťchová, I., Kučera, I., Janiczek, O., Van Spanning, R.J.M., Oltmann L.F. (1993) Arch Microbiol. 159: 272-275. Mazoch, J. (2004) Disertační práce - Regulace syntézy denitrifikační dráhy u bakterie Paracoccus denitrificans. Mazoch, J., Tesařík, R., Sedláček, V., Kučera, I., Turánek, J. (2004) Eur J Biochem. 271: 553- 562. Mazoy, R., Lopez, E.M., Fouz, B., Amaro, C., Lemos, M.L. (1999) FEMS Microbiol Lett. 172: 205-11. Meng, X.J., Paul P.S., Halbur, P.G., Lum, M.A. (1995) Arch Virol. 140: 745-755. Merril, C.R. (1990) Methods Enzymol. 182: 477-88. Meulenberg, J.J., Hulst, M.M., de Meijer, P., Moonen, J.M., den Besten, A., de Kluyver, E.P., Wensvoort, G., Moormann, R.J.M. (1993) Virology. 192: 62-74. Meulengerg, J.J., Bende, R.J., Pol, J.M.A., Wensvoort G., Moormann, R.J.M. (1995a) Clin Diagn Lab Immunol. 2: 625-656. Meulenberg, J.J., Petersen-den Besten, A., De Kluyver, E.P., Moormann, R.J., Schaaper, W.M., Wensvoort, G. (1995b) Virology. 206:155-63. Meulenberg, J.J. (2000) Vet Res. 31: 11-21. Michaliszyn, G.A., Wing, S.S., Meighen, E.A. (1977) J Biol Chem. 252: 7495-7498. Miller, L.K. (1995) J Invertebr Pathol. 65: 211-216. Miller, L.K. (1997) The Baculoviruses. Plenum Press. New York. Moir, J.W.B., Ferguson, S.J. (1994) Microbiology. 140: 389-397. Moody, M.D., Dailey, H.A. (1985) J Bacteriol. 163: 1120-1125. Murphy, F.A., Fauquet, C.M., Bishop, D.H.L., Ghabrial, S.A., Narcis, A.W., Martelli, G.P. (1995) Arch Virol Suppl. 10: 104. Murphy, M.J., Siegel, L.M., Kamin, H., Rosenthal, D. (1973) J Biol Chem. 248: 2801-2814. Neilands, J.B. (1995) J Biol Chem. 270: 26723-26726. Nelson, E.A., Christopher-Hennings, J., Drew, T., Wensvoort, G., Collins, J.E., Benfield, D.A. (1993) J Clin Microbiol. 31: 3184-3189. 86 Nelson, E.A., Christopher-Hennings, J., Benfield, D.A. (1995) Adv Exp Med Biol. 380:321-3. Nodelijk, G., Wensvoort, G., Kroese, B., van Leengoed, L., Colijn, E., Verheijden J. (1996) Vet Microbiol. 49: 285-95. Ornstein, L. (1964) Ann N Y Acad Sci. 121: 321-49 Park, C.H., Keyhan, M., Wielinga, B., Fendorf, S., Matin, A. (2000) Appl Environ Microbiol. 66: 1788­1795. Pauling, L., Itano, H.A. (1949) Science. 110: 543-8. Perry, J.J., Stanley J.T. (1997) Microbiology: dynamic and diversity, Saunders College Publishing. Pier, A.C., Hodges, A.B., Lauze, J.M., Raisbeck, M. (1995) J Med Vet Mycol. 33: 93-7. Pinter, L., Ellis, H. J., Ciclitira, P. J., Noble, W. C. (1995) Vet Microbiol. 46: 435-44. Poch, M.T., Johnson, W. (1993) Biometals. 6: 107-114. Porath, J., Flodin, P. (1959) Nature. 183: 1657-9. Pšikal, I., Indik, S., Valíček, L., Nejedlá, E., Kubalíková, R., Kosinová, E. (1998) Scripta Medica. 71: 410. Pšikal, I., Kosinová, E. (2006) Veterinářství. 5: 302-306. Regnier, F.E. (1983) Science. 222: 245-52. Righetti, P.G. (1983) Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications. Elsevier, Amsterdam. Richey, J. (1982) Am Lab. 14: 104-29. Rohrmann, G.F. (1992) J Gen Virol. 73: 749-761. Rozkošná, K. (2003) Diplomová práce - Tvorba a vlastnosti rozpustných Fe(III) reduktáz bakterie Paracoccus denitrificans. Rybnikar, A., Vrzal, V., J. Chumela. (1987) Acta Vet Brno. 66:57-60. Sarkisov, A.K., Petrovich, S.V., Nikiforov, L.I. (1971) Veterinarya. 48: 54-6. Sears, H. J., Bennett, B., Spiro, S., Thomson, A.J., Richardson D.J. (1995) Biochem J. 310: 311-314. Seeliger, S., Cord-Ruwisch, R., Schink, B. (1998) J Bacteriol. 180: 3686-3691. 87 Seuberlich, T., Tratschin, J.D., Thür, B., Hofmann, M.A. (2002) Clin Diagn Lab Immunol. 9: 1183-1191. Short, K.A., Blakemore, R.P. (1986) J Bacteriol. 167: 729­731. Schröder, I., Johnson, E., de Vries, S. (2003) FEMS Microbiol Rev. 27: 427-447. Siddiqui, R.A., Warnecke-Eberz, U., Hengsberger, A., Schneider, B., Kostka S., Friedrich, B. (1993) J Bacteriol. 175: 5867-5876. Siegel, L.M., Davis, P.S. (1974) J Biol Chem. 249: 1587-1598. Siegel, L.M., Murphy, M.J., Kamin, H. (1973) J Biol Chem. 248: 251-264. Smith, J.M.B., Griffin, J.F.T. (1995) J Med Vet Mycol. 33: 87-91. Smithies, O. 1955 Biochem J. 61: 629-41. Snijder, E.J., Meulenberg, J.J.M. (1998) J Gen Virol. 79: 961-979. Snyder, S.W., Hollocher, T.C. (1987) J Biol Chem. 262: 6515-6525. Sober, H.A., Peterson, E.A. (1958) Fed Proc. 17: 1116-26. Sohnle, P.G., Murphy, J.W., Friedman, H., Bendinelli M. (1993) In Fungal Infections and Immune Responses. Plenum Publishing Corp., New York, p. 27. Sorensen, K.J., Botner, A., Madsen, E.S., Strandbygaard, B., Nielsen, J. (1997) Vet Microbiol. 56: 1-8. Southern, E.M. (1975) J Mol Biol. 98: 503-517 Sparkes, A.H., Stokes, C.R., Gruffydd-Jones, T.J. (1994) Mycopathologia. 128: 91-98. Suarez, P., Zardoya, R., Martin, M.J., Prieto, C., Dopazo, J., Solana, A., Castro, J.M. (1996) Virus Res. 42: 159-165. Takikawa, N., Kobayashi, S., Ide, S., Yamane, Y., Tanaka, Y., Yamagishi, H. (1996) J Vet Med Sci. 58: 355-357. Tiselius, A. (1937a) Biochem J. 31: 1464-77. Tiselius, A. (1937b) Biochem J. 31: 313-7. Valíček, L., Pšikal, I., Šmíd, B., Indík, S., Rodák, L., Kosinová, E. (1999) Vet Med-Czech. 44: 289-294. 88 van Spanning, R.J.M., Wansell, C., Harms, N., Oltmann, L.F., Stouthamer, A.H. (1990) J Bacteriol. 172: 986-996. van Spanning, R.J.M., de Boer, A.P.N., Reijnders, W.N.M., De Gier, J.W.L., Delorme, C.O., Stouthamer, A.H., Westerhoff, H.V., Harms, N., van der Oost, J. (1995) J Bioenerg Biomembr. 27: 499-512. Vartivarian, S.E., Cowart, R.E. (1999) Arch Biochem Biophys. 364: 75-82. Vasudevan, S.G., Armarego, W.L., Shaw, D.C., Lilley, P.E., Dixon, N.E., Poole, R.K. (1991) Mol Gen Genet. 226: 49-58. Weitzman, I., Summerbell, R.C. (1995) Clin Microbiol Rev. 8: 240-59. Wensvoort, G., Terpstra, C., Pol, J.M.A., Ter Laak, E.A., Bloemraad, M., de Kluyver, E.P., Kragten, C., van Buiten, L., den Besten, A., Wagenaar, F., Broekhuilsen, J.M., Moonen, P.L.J.M., Zetstra, T., de Boer, E.A., Tibben, H.J., de Jog, M.F., van´t Veld, P., Groenland, G.J.R., van Gennep, J.A., Voets, M.T., Verheijden, J.H.M., Braamskamp, J. (1991) Vet Q. 13: 121-130. Wilson, C.M. (1983) Methods Enzymol. 91: 236-247. Witte, S.B., Chard-Bergstrom, C., Loughin, T.A., Kapil, S. (2000) Clin Diagn Lab Immunol. 7: 700-702. Woodfolk, J.A., Platts-Mills, T. A. E. (1998) Res Immunol. 149: 436-45. Yoon, I.J., Joo, H.S., Christianson, W.T., Kim, H.S., Collins, J.E., Morrison, R.B., Dial, G.D. (1992) J Vet Diagn Invest. 4: 144-147. Yoon, K.J., Zimmermann, J.J., Swenson, S.L., McGinley, M.J., Eernisse, K.A., Brevik, A., Rhinehart, L.L., Frey, M.L., Hill, H.T., Platt, K.B. (1995) J Vet Diagn Invest. 7: 305- 312. Zrimsek, P., Kos, J., Pinter, L., Drobnic-Kosorok, M. (1999) Vet Microbiol. 70: 77-86. Zumft, W.G., Braun, C. and Cuypers, H. (1994) Eur J Biochem. 219: 481-490. 89 9. Prezentované výsledky Tesařík R., Mazoch, J., Turánek, J. and Kučera, I.: Purification and characterization of ferric reductases from Paracoccus denitrificans. XVIII.biochemický sjezd s mezinárodní účastí Stará Lesná, Slovenská republika, 2002. Kosinová, E., Pšikal, I., Tesařik, R. and Rodák, L.: Expression of ORF7 gene encoding the nucleocapsid protein N of PRRS virus by means of a baculovirus vector in insect cells. XVIII. biochemický sjezd s mezinárodní účastí Stará Lesná, Slovenská republika, 2002. Kosinová, E., Pšikal, I., Tesařik, R. and Rodák, L.: Expression of open reading frame 7 gene encoding the nucleocapsid protein N of PRRS virus by means of a baculovirus vector in insect cells. VII. Pracovní setkání biochemiků a molekulárních biologů, Brno, 2003. Kosinová, E., Pšikal, I., Tesařík, R. and Rodák, L.: Exprese genu ORF7 kódující nukleokapsidový protein N viru PRRS prostřednictvím bakulovirového vektoru v hmyzích buňkách. XII. konference mladých mikrobiologů Tomáškovy dny, Brno, 2003. Kosinová, E., Pšikal, I., Tesařík, R. and Rodák, L.: Expression of ORF7 gene encoding the nucleocapsid protein N of PRRS virus by means of a baculovirus vector in insect cells. XVIIth Biological Days, Memory in living systems, Brno, 2003. Tesařík, R., Pšikal, I., Kosinová, E. and Rodák, L.: Preparative SDS-PAGE: Purification of the nucleocapsid protein N of porcine reproductive and respiratory syndrome virus expressed by means of a baculovirus vector in insect cells. VIII. Pracovní setkání biochemiků a molekulárních biologů, Brno, 2004. 90 Tesařík, R., Mazoch, J., Turánek, J., Kučera, I. and Sedláček, V.: Purification and characterization of iron(III) reductases from Paracoccus denitrificans. XIX.biochemický sjezd s mezinárodní účastí Olomouc, Česká republika, 2004. Kosinová E., Pšikal, I., Tesařík, R. and Rodák, L.: Exprese genu ORF7 kódující nukleokapsidový protein N viru PRRS pomocí bakulovirového expresního systému. Československá společnost mikrobiologická, Brno, 2006. Pšikal, I., Marčeková, Z., Kosinová, E., Tesařík, R. and Šebo, P.: E. coli expressed recombinant antigen from sequnce-optimized ORF2 encoding capsid protein of porcine circovirus type 2 (PCV2). International Conference on Circoviruses, Belfast, Northern Ireland, 2005. Procházka, L., Turánek J., Tesařík, R., Andrysík, Z., Kozubík, A., Sova, P., Kroutil, A., Žák, F., Mistr A. and Machala, M.: Biochemical events in preapoptotic stage of cells: inhibition of gap junction intercellular communication by new platinum complex LA-12 through ERK1/2 activation in. X. Pracovní setkání biochemiků a molekulárních biologů, Brno, 2006. Pšikal, I., Kosinová, E., Marčeková, Z., Tesařík, R. and Bendová, J.: Comparison of two ELISA techniques for monitoring antibody response to porcine circovirus type 2 in pig sera. 19th IPVS Congress, Copenhagen, Danmark, 2006. 91 10. Seznam publikovaných prací Koutný, M., Kučera, I. Tesařík, R., Turánek, J. and van Spanning R.J.M. (1999) Pseudoazurin mediates periplasmic electron flow in a mutant strain of Paracoccus denitrificans lacking cytochrome c550. FEBS Letters. 448: 157-159. Mazoch, J., Tesařík, R., Sedláček, V., Kučera, I. and Turánek, J. (2004) Isolation and biochemical characterization of two soluble iron(III) reductases from Paracoccus denitrificans. Eur J Biochem. 271(3): 553-562. Faldyna, M., Oborilova E., Krejci J., Tesarik R., Krejci E., Pavlova B. and Rybnikar A. (2007) A correlation of in vitro tests for the immune response detection: A bovine trichophytosis model. Vaccine. 25: 7948-54. Procházka, L., Turánek, J., Tesařík, R., Knotigová, P., Polášková, P., Andrysík, Z., Kozubík, A., Žák, F., Sova, P., Neužil, J. and Machala, M. (2007) Apoptosis and inhibition of gap-junctional intercellular communication induced by LA-12, a novel hydrophobic platinum(IV) complex. Arch Biochem Biophys. 462(1): 54-61 11. Aplikované výstupy Pšikal, I., Rodák, L., Kosinová, E. and Tesařík, R. (2006) Inovovaná diagnostická souprava PRRS IgG ELISA k průkazu protilátek proti viru PRRS. 12. Ocenění Tesařík R., Mazoch J., Turánek J., Kučera I. and SedláčekV. Purification and characterization of iron(III) reductases from Paracoccus denitrificans. Vítězná práce a cena firmy Bio-Rad na XIX.biochemickém sjezdu s mezinárodní účastí Olomouc, Česká republika, 2004. 92 Procházka, L., Turánek J., Tesařík, R., Andrysík, Z., Kozubík, A., Sova, P., Kroutil, A., Žák, F., Mistr A. and Machala, M.: Biochemical events in preapoptotic stage of cells: inhibition of gap junction intercellular communication by new platinum complex LA-12 through ERK1/2 activation in. Vítězná práce v sekci mladých na X. Pracovním setkání biochemiků a molekulárních biologů, Brno, 2006. 93 13. Přílohy Pseudoazurin mediates periplasmic electron flow in a mutant strain of Paracoccus denitrificans lacking cytochrome c550. FEBS Letters (1999) 448: 157-159 Isolation and biochemical characterization of two soluble iron(III) reductases from Paracoccus denitrificans. Eur J Biochem (2004) 271(3): 553-562 A correlation of in vitro tests for the immune response detection: A bovine trichophytosis model. Vaccine (2007) 25: 7948-54 94 Pseudoazurin mediates periplasmic electron ow in a mutant strain of Paracoccus denitricans lacking cytochrome cSSH Marek Koutny , Igor KucíeraY *, Radek Tesarí|k , Jaroslav Turanek , Rob J.M. Van Spanning Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kotlaríska 2, CZ-61137 Brno, Czech Republic Department of Immunology, Veterinary Research Institute, Hudcova 70, CZ-62132 Brno, Czech Republic Department of Molecular Cell Physiology, Faculty of Biology, Free University, De Boelelaan 1087, NL-1081 HV Amsterdam, The Netherlands Received 2 February 1999 Abstract A periplasmic protein able to transfer electrons from cytoplasmic membrane to the periplasmic nitrite reductase (cytochrome cd1) has been purified from the anoxically grown cytochrome c550 mutant strain Pd2121 and shown to be pseudoazurin by several independent criteria (molecular mass, copper content, visible spectrum, N-terminal amino acid sequence). Under our assay conditions, the half-saturation of electron transport occurred at about 10 WWM pseudoazurin; the reaction was retarded by increasing ionic strength. z 1999 Federation of European Biochemical Societies. Key words: Pseudoazurin; Nitrite reduction; Electron transport; Paracoccus denitricans 1. Introduction The denitrication pathway of Paracoccus denitricans involves, in addition to the membrane-bound nitrate and nitric oxide reductases, two water-soluble enzymes that are located within the periplasmic space of the cell: nitrite reductase and nitrous oxide reductase [1]. The molecular basis for electron transport between the membrane and these periplasmic enzymes has not yet been completely resolved. Although a periplasmic c-type cytochrome designated cytochrome cSSH is known to shuttle electrons in cell-free systems [2], phenotype characteristics of a cytochrome cSSH-decient mutant strain [3] disprove an obligatory role for this protein in denitrication and prompt speculations over a possible substitute. The participation of another c-type cytochrome has been suggested [4], based on the results of reconstitution experiments using subcellular fractions and on correlations between the cellular levels of proteins and enzyme activities. However, two other pieces of evidence favor electron transport via a copper protein: (i) a diminished activity of nitrite reduction in the cytochrome cSSH mutant cells grown under copper deciency [5] and (ii) an inhibition by the copper chelator diethyldithiocarbamate (DDC), which is more pronounced in the mutant than in the wild-type cells [6]. In view of the persisting uncertainty, the present work aims at resolving the nature of the periplasmic electron carrier. 2. Materials and methods 2.1. Growth of cells The cytochrome cSSH insertion mutant strain Pd2121 was grown at 30C in a synthetic medium containing 50 mM sodium succinate and 10 mM KNOQ [7], supplemented with 50 Wg/ml kanamycin. Precultures of 30 ml were used to inoculate 3 l asks lled with the medium and the cultures were incubated statically for 22 h. Cells were harvested by centrifugation at 5500Ug for 30 min and washed once in 0.1 M sodium phosphate buer (pH 7.3). 2.2. Purication procedure Step 1. Preparation of a periplasmic fraction. Periplasm was released from the freshly harvested cells (13U3 l of culture in total) by treatment with lysozyme followed by a mild osmotic shock as described [8], concentrated with Minitan lter plates (Millipore) to approximately 250 ml and claried by centrifugation at 40 000Ug for 40 min. Step 2. First ion-exchange chromatography. The concentrated solution of periplasmic proteins was loaded onto a Sepharose Q (Pharmacia) column (16U300 mm) pre-equilibrated with 20 mM Tris-HCl buer (pH 7.3) and eluted with a 600 ml linear gradient (0^1 M NaCl, pH 7.3) at a ow rate of 1.5 ml/min. Fractions of 5 ml were collected; those containing a reconstitutive activity were pooled and concentrated by ultraltration to a volume of 10 ml. Step 3. Gel permeation chromatography. The sample was applied in two separate batches to a Superose 12 (Pharmacia) column (30U600 mm) equilibrated with 150 mM NaCl in 50 mM sodium phosphate (pH 7.3) and eluted with the same buer, at a ow rate of 0.5 ml/min and a fraction volume of 5 ml. Step 4. Second ion-exchange chromatography. After desalting with a Sephadex G25 column (5 ml), nal purication of the pooled reconstitutively active fractions was achieved on a MonoQ Superose (Pharmacia) column (1 ml) equilibrated with 20 mM Na-HEPES (pH 7.2). After loading, elution was done with a 20 ml linear gradient (0^300 mM NaCl, pH 7.2) at 0.5 ml/min; individual peaks were col- lected. 2.3. Enzyme assays Reconstitution of the succinate-nitrite reductase activity was carried out by adding samples (100 Wl) to the reaction mixture (40 Wl) containing Tris-HCl buer (pH 7.3), 2 Wmol; sodium succinate, 2.5 Wmol; crude nitrite reductase, 0.3 mg protein and membrane vesicles, 0.35 mg protein, yielding a nal volume of 140 Wl. After 20 min of incubation at 30C, the reaction was started with 7.5 Wl of 10 mM NaNOP and terminated with 50 Wl of saturated zinc acetate 30 min later. The disappearance of nitrite was followed colorimetrically [9] in the super- natants. For the determination of peroxidase, a microplate assay was adopted: 5 Wl of the sample was mixed with 200 Wl of 0.1 M sodium acetate (pH 6.0) containing 0.2 mg/ml 3,3P,5,5P-tetramethylbenzidine dihydrochloride and 1.8 mM hydrogen peroxide and absorbance at 650 nm was recorded on a Multiscan microplate reader (Labsystem). 2.4. Analytical methods Protein contents of fractions were measured by the method of Bradford [10] using bovine serum albumin as standard. Absorption spectra were recorded at 25C in an Ultrospec 2000 UV/Vis instrument (Pharmacia Biotech) linked to a PC. 0014-5793/99/$20.00 ß 1999 Federation of European Biochemical Societies. All rights reserved. PII: S 0 0 1 4 - 5 7 9 3 ( 9 9 ) 0 0 3 4 5 - 2 *Corresponding author. Fax: +42 (5) 41211214. E-mail: ikucera@chemi.muni.cz Abbreviations: AAS, atomic absorption spectroscopy; DDC, diethyldithiocarbamate; SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis FEBS 21813 FEBS Letters 448 (1999) 157^159 Copper concentrations of puried protein preparations (20 Wl, in triplicate) were analyzed by atomic absorption spectroscopy using a Perkin-Elmer 3030 AA spectrophotometer equipped with a HGA 74 graphite furnace. SDS-PAGE was performed in 12.5% (w/v) acrylamide slab gels (6 cmU8 cmU0.75 mm) using a Mini Protean chamber system (Bio-Rad) [11]. SDS-PAGE standard proteins were obtained from Fluka. Gels were stained with Coomassie Brilliant Blue and destained in 40% methanol/10% acetic acid. N-terminal amino acid sequence was determined by Edman degradation and subsequent analysis of the amino acids with a model 473A gas-phase amino acid Sequenator (Applied Biosystems). Protein sample was electrotransferred from PAGE to a poly(vinylidene diuoride) membrane (Bio-Rad) before sequencing. 3. Results Initial studies indicated that reduction of nitrite by succinate in a cell-free system required the presence of a factor stemming from the bacterial periplasm. As documented in Fig. 1, the reconstitutive activity eluted in single peaks during successive chromatographic purication steps. There were differences in the elution volume between this activity and the components absorbing at 410 nm and exhibiting peroxidase activity. At the end of the purication procedure, approximately 2 mg of a reconstitutively active protein were obtained from a 39 l culture. SDS-PAGE of this preparation gave a single band at an Mr of 14 000 (Fig. 2). The same value of Mr was found by the column chromatography (not shown), indicating a monomeric form of the protein in the solution. Eectiveness of the puried 14 000-Mr protein as an electron carrier in our assay system is demonstrated by the results of Fig. 3. A characteristic feature was the saturability of the reaction rate at relatively low mediator concentration. The saturation curve reminiscent of a Michaelis^Menten curve afforded the calculation of an apparent Km as 9.7 WM. Additions of an inert electrolyte (NaCl) had a signicant inhibitory eect on the reconstituted activity, 50% diminution being achieved at 0.2 M (results not shown). Further work centered about the question of whether a heme or a copper prosthetic group is associated with the 14 000-Mr protein. The absorption spectrum of an oxidized but not reduced sample showed a pronounced maximum close to 590 nm (Fig. 4), which is typical for a family of type-1 copper proteins [12]. With atomic absorption spectroscopy, a content of 58 nmol of copper per mg of protein was determined, corresponding to 0.81 atoms of copper per molecule at 14 000-Mr. Denite identication of the protein became possible after N-terminal sequencing. The obtained sequence of 20 amino acids, ATHEVHMLNKGESGAMVFEP, is identical to that reported for P. denitricans pseudoazurin [13]. Fig. 1. Elution proles for a typical purication run. Chromatographic conditions are specied in Section 2.2. A: Sepharose Q (step 2); B: Superose 12 (step 3); C: MonoQ Superose (step 4); D: a repeated MonoQ Superose (step 4). Solid lines, absorbance at 280 nm; broken lines, absorbance at 410 nm; dot/dash lines, NaCl gradient; solid circles, nitrite reductase activity after reconstitution, expressed in nmol xy3 2 /min per 1 Wl of the eluate and multiplied by 120 (a scaling factor); empty circles, peroxidase activity expressed as vATSH/vt (min3I ) per 1 Wl of the eluate and multiplied by 1000. In C and D, the peaks containing reconstitutive activity are indicated by arrows. Fig. 2. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of the puried protein. Lane A contained 50 Wg of a mixture of standard proteins (Fluka) with the indicated molecular masses, lane B 4 Wg of the nal preparation. Fig. 3. Reconstitution of nitrite reductase activity brought about by the puried electron carrier. Reaction conditions were accomplished as described in Section 2.3 except that the reaction time was appropriately reduced. Each point shown is the mean of triplicate measurements S.D., the line represents the t to the Michaelis^Menten equation (Km = 9.7 WM, Vmx = 35.0 nmol xy3 2 /min). M. Koutny et al./FEBS Letters 448 (1999) 157^159158 4. Discussion Resolution and reconstitution experiments presented above have established that P. denitricans grown anoxically contains a small soluble protein which is able to restore the activity of succinate-nitrite reductase when incubated with membrane vesicles and nitrite reductase. This redoxactive protein is now identied as pseudoazurin by its molecular mass, the content of copper, visible spectrum and N-terminal amino acid sequence. New conclusive identication corroborates earlier ndings reached by indirect experimental approaches [5,6] and weakens an alternative interpretation according to which the eects of DDC result from a Cu-independent inhibition in combination with a direct electron donation to cytochrome c [14]. Disparity in the elution proles of the reconstitutive activity, Soret absorption and (pseudo)peroxidase (Fig. 1) suggests that the presence of a c-type cytochrome in some previously studied redoxactive preparations [4] may be merely coincidental. In their investigation of Thiosphaera pantotropha (a close relative to P. denitricans) Moir and colleagues [15] found a Michaelis constant of 220 WM for the reaction of pseudoazurin with nitrite reductase and considered it to be telling about the actual concentrations of pseudoazurin needed in the periplasm. However, this is justied only if the control of electron ow resides exclusively in the terminal nitrite reductase step. At a low (rate-limiting) electron-transfer capacity for reduction of pseudoazurin by the respiratory chain the half-saturation concentration may dier. More detailed studies of pseudoazurin redox reactions should allow us to decide whether the 22 times lower value reported here (Fig. 3) reects such kinetic factors or some interspecic dierences between P. denitricans and T. pantotropha. Acknowledgements: The authors wish to thank K. Novotny, Department of Analytical Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, for his kind help in AAS. References [1] Baker, S.C., Ferguson, S.J., Ludwig, B., Page, M.D., Richter, O.M.H. and Van Spanning, R.J.M. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 1046^1078. [2] Maťchova, I. and Kucíera, I. (1991) Biochim. Biophys. Acta 1058, 256^260. [3] Van Spanning, R.J.M., Wansell, C., Harms, N., Oltmann, L.F. and Stouthamer, A.H. (1990) J. Bacteriol. 172, 986^996. [4] Maťchova, I., Kucíera, I., Janiczek, O., Van Spanning, R.J.M. and Oltmann, L.F. (1993) Arch. Microbiol. 159, 272^275. [5] Van Spanning, R.J.M., de Boer, A.P.N., Reijnders, W.N.M., De Gier, J.-W.L., Delorme, C.O., Stouthamer, A.H., Westerho, H.V., Harms, N. and van der Oost, J. (1995) J. Bioenerg. Biomembr. 27, 499^512. [6] Moir, J.W.B. and Ferguson, S.J. (1994) Microbiology 140, 389^ 397. [7] Kucíera, I. and Kaplan, P. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1276, 203^209. [8] Alefounder, P.R. and Ferguson, S.J. (1980) Biochem. J. 192, 231^ 240. [9] Snell, F.D. and Snell, C.T. (1949) Colorimetric Methods of Analysis, Van Nostrand, New York, p. 804. [10] Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248^254. [11] Bollag, D.M. and Edelstein, S.J. (1991) Protein Methods, WileyLiss, New York, pp. 96^127. [12] Liu, M.-Y., Liu, M.-C., Payne, W.J. and LeGall, J. (1986) J. Bacteriol. 166, 604^608. [13] Leung, Y.-C., Chan, C., Reader, J.S., Willis, A.C., Van Spanning, R.J.M., Ferguson, S.J. and Radford, S.E. (1997) Biochem. J. 321, 699^705. [14] Kucíera, I. (1996) FEMS Microbiol. Lett. 135, 93^96. [15] Moir, J.W.B., Baratta, D., Richardson, D.J. and Ferguson, S.J. (1993) Eur. J. Biochem. 212, 377^385. Fig. 4. Absorbance spectra of the puried protein. The sample cuvette contained 0.2 ml of 50 mM Na-HEPES buer, pH 7.0; the protein concentration was 0.26 mg/ml. The inset shows the same spectrum in the region 350^800 nm and its appearance after reduction with a few crystals of ascorbic acid. M. Koutny et al./FEBS Letters 448 (1999) 157^159 159 Isolation and biochemical characterization of two soluble iron(III) reductases from Paracoccus denitrificans Jiří Mazoch1 , Radek Tesařík2 , Vojtě ch Sedlá ček1 , Igor Kučera1 and Jaroslav Turá nek2 1 Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Brno, Czech Republic; 2 Department of Immunology, Veterinary Research Institute, Brno, Czech Republic Two soluble enzymes (FerA and FerB) catalyzing the reduction of a number of iron(III) complexes by NADH, were purified to near homogeneity from the aerobically grown iron-limited culture of Paracoccus denitrificans using a combination of anion-exchange chromatography (Sepharose Q), chromatofocusing (Mono P), and gel permeation chromatography (Superose 12). FerA is a monomer with a molecular mass of 19 kDa, whereas FerB exhibited a molecular mass of about 55 kDa and consists of probably two identical subunits. FerA can be classified as an NADH:flavin oxidoreductase with a sequential reaction mechanism. It requires the addition of FMN or riboflavin for activity on Fe(III) substrates. In these reactions, the apparent substrate specificity of FerA seems to stem exclusively from different chemical reactivities of Fe(III) compounds with the free reduced flavin produced by the enzyme. Observations on reducibility of Fe(III) chelated by vicinal dihydroxy ligands support the view that FerA takes part in releasing iron from the catechol type siderophores synthesized by P. denitrificans. Contrary to FerA, the purified FerB contains a noncovalently bound redox-active FAD coenzyme, can utilize NADPH in place of NADH, does not reduce free FMN at an appreciable rate, and gives a pingpong type kinetic pattern with NADH and Fe(III)-nitrilotriacetate as substrates. FerB is able to reduce chromate, in agreement with the fact that its N-terminus bears a homology to the previously described chromate reductase from Pseudomonas putida. Besides this, it also readily reduces quinones like ubiquinone-0 (Q0) or unsubstituted p-benzo- quinone. Keywords: iron(III) reductase; NADH:flavin oxidoreductase; Paracoccus denitrificans. Ferric iron [Fe(III)] reductases, which catalyze the reduction of various complexed forms of Fe(III), are of ubiquitous occurrence in nature [1]. Conversion of Fe(III) to more soluble Fe(II) generally increases the bioavailability of iron and occurs either outside the cell [in conjunction with an upward Fe(II) transport] or intracellularly (e.g. iron release from the accumulated ferrisiderophores) [2]. In bacteria, environmental Fe(III) can serve as a hydrogen sink, allowing the regeneration of NAD+ [3], or even as a terminal electron acceptor in an anaerobic respiration associated with translocation of H+ and generation of a transmembrane potential difference [4,5]. Fe(III) reductases constitute a heterogeneous group of enzymes in respect to their biochemical properties. The majority of the known bacterial Fe(III) reductases resides in the cytoplasm, consists of one small polypeptide chain lacking any distinguishable prosthetic group, reduces Fe(III) at the expense of NADH or NADPH and requires flavin as an electron transfer mediator [6­13]. On the contrary, Fe(III) reductases of Fe(III) respirers are c-type cytochromes excreted into the medium or exposed at the cell surface where they can make direct contact with the solid metal oxides [14,15]. A representative of eukaryotic type enzymes is the FRE1 Fe(III) reductase of Saccharomyces cerevisiae, a transmembrane flavocytochrome b with properties similar to those of the NADPH oxidase of human neutrophils [16]. In some instances the observed reduction of Fe(III) possibly represents a side activity of an enzyme that may catalyze a different reaction in vivo, as exemplified by the enzymes flavin reductases [12], sulfite reductase [17] or dihydropteridine reductase [18]. The facultative anaerobe Paracoccus denitrificans possesses a flexible respiratory chain able to incorporate considerable amounts of iron-containing proteins in response to the changed growth conditions [19,20]. This ability depends in part upon a capacity of the microbe to mobilize iron from external and internal sources. Evidence for a high-affinity iron-scavenging system involving low molecular weight, Fe(III)-specific siderophores was first presented by Tait [21] who isolated three iron-binding catechol compounds from the culture supernatant of P. denitrificans and provided initial data on their structure, metal-binding properties and enzymes needed for their biosynthesis. Since then, several Correspondence to I. Kuč era, Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kotlá ř ská 2, CZ-61137 Brno, Czech Republic. Fax: + 420 541129623, Tel.: + 420 541129351, E-mail: ikucera@chemi.muni.cz Abbreviations: Bis/Tris, bis(2-hydroxyethyl)amino-tris(hydroxymethyl)methane; DHB, 2,3-dihydroxybenzoate; FNR, fumarate and nitrate reductase regulator (Escherichia coli); FnrP, FNR homologue from P. denitrificans; NfsB, oxygen-insensitive nitroreductase of E. coli; PVDF, poly(vinylidene difluoride); pyrocat, pyrocatechol; QR, quinone reductase. (Received 30 September 2003, revised 27 November 2003, accepted 5 December 2003) Eur. J. Biochem. 271, 553­562 (2004) Ó FEBS 2004 doi:10.1046/j.1432-1033.2003.03957.x thorough investigations into the mechanism, stereospecificity and kinetics of siderophore-mediated iron transport in P. denitrificans have been carried out [22­24], but information on the enzymology of Fe(III) reduction still remains scarce and incomplete. Tait [21] described formation of Fe(II) from the Fe(III)­siderophore complex upon incubation with NADH, succinate and an ultracentrifuged and dialyzed cell-free extract while Dailey and Lascelles [25] noticed reduction of Fe(III) citrate by NADH or succinate as electron donors in the presence of crude cell extracts containing membranes. More recently, Kucera and Matchova [26] succeeded in discriminating between the reduction of Fe(III) sulfate by NADH catalyzed by cytosolic and membrane fractions. The former reaction differed markedly from the latter by about 10-times lower apparent Km value for NADH, by a discernible stimulatory effect of FMN, and by the inability of succinate to substitute for NADH. The present report describes the results of studies leading to the conclusion that at least two distinct soluble enzymes of P. denitrificans exhibit an activity of Fe(III) reductase. These enzymes were purified and their molecular and catalytic properties were analyzed. The data obtained indicate that one of them can be assigned to the NADH-dependent flavin reductases while the other carries a bound flavin prosthetic group and bears a resemblance to a previously described enzyme capable of reducing chromate [27]. Materials and methods Organism and cultivation Paracoccus denitrificans, strain CCM 982 was obtained in freeze-dried form from the Czech Collection of Microorganisms (CCM), Masaryk University, Brno, Czech Republic. It was maintained on agar plates and stored at 4 °C. Growth was achieved via batch cultivation using minimal succinate medium, containing (in mM) sodium succinate, 50; KH2PO4, 33; Na2HPO4, 17; NH4Cl, 50; MgSO4, 1.1 and Fe(III) citrate, 0.5 lM. The final pH was adjusted to 7.3 by dropwise addition of 0.1 M NaOH. Separate 750 mL aliquots were autoclaved in 3-L Erlenmeyer flasks, inoculated with 20 mL of a pregrown culture and incubated for 10­12 h at 30 °C on a reciprocal shaker at 180 r.p.m. Cells were sedimented by centrifugation (6200 g, 20 min at 4 °C), washed twice with 50 mM Tris/HCl buffer, pH 7.4, and then taken up in this buffer. Preparation of the enzymes For a typical purification % 10 g wet cells harvested from 3-L culture were used. Chromatography was run on a Pharmacia FPLC apparatus. Step 1: Preparation of cell-free extract. Cell-free extracts were made by passing the cell suspension twice through a 33-mL X-Press cell (AB Biox, Sweden), treating with 4 lg of deoxyribonuclease (Sigma) per mL for 30 min at room temperature to reduce the viscosity caused by DNA and removing the cellular debris by centrifugation at 109 000 g for 40 min in a rotor-type 45 TI (Beckman). The Fe(III) reductase-containing extracts were stored at )15 °C until commencement of purification. Step 2: Ion exchange chromatography. About 40 mL of cell-free extract, prepared as described above, were loaded onto an HP Sepharose Q (Pharmacia) column (XK26: 10 cm 2.6 cm) pre-equilibrated with 20 mM Tris/HCl, pH 7.4, and washed by the same buffer. The proteins were eluted in two phases with 300 mL of linear gradient of 0­0.6 M NaCl and 50 mL of linear gradient of 0.6­1 M NaCl at a flow rate of 0.8 mLmin)1 . Fractions of 5 mL were collected and those displaying Fe(III) complex reductase activity were pooled (each activity peak separately), concentrated in an ultrafiltration cell (Amicon) through YM-3 membrane (Millipore) and then dialyzed against 20 mM Tris/HCl, pH 7.4. Step 3: Chromatofocusing. Two buffer systems in this chromatography on MonoP HR 5/20 (Pharmacia) column (20 0.5 cm) for two distinct enzymes were employed. First, starting with 0.075 M Tris/acetate, pH 9.3 used Polybuffer 96, second one started with 0.025 M Bis-Tris/ iminodiacetic acid, pH 7.1, and Polybuffer 74 (Pharmacia) was applied here, according to instructions of the manufacturer. The flow rate was 0.3 mLmin)1 during sample loading and 0.5 mLmin)1 during focusing. Fractions of 0.5 mL were collected. Pooled active fractions were desalted on PD-10 columns (Supelco) equilibrated by the start buffer for the next step. Step 4 (optional): Chromatofocusing. The same conditions as in the previous step with Polybuffer 74 were used. Peak fractions were collected. Step 5: Gel permeation chromatography. Maximum 0.5 mL of sample was loaded onto Superose 12 (Pharmacia) analytical column (30 cm 1 cm) equilibrated by 50 mM Tris/HCl, pH 7.4 containing 150 mM NaCl. The flow rate after sample application was 0.5 mLmin)1 . For determination of molecular masses, the same column was calibrated by marker proteins including alcohol dehydrogenase (141 kDa), albumin (67 kDa), ovalbumin (43 kDa), chymotrypsinogen A (25 kDa) and ribonuclease A (13.7 kDa). Step 6 (optional): Preparative native electrophoresis. In some instances (e.g. for N-terminal sequenation), final purification of the enzymes was performed from the activity bands on native gels (see below). The proteins were recovered by electroelution using electroelution tubes and a Mini Protean Cell (Bio-Rad) with Tris/glycine buffer, pH 8.3 [no sodium dodecyl sulfate (SDS)] at constant current 8 mA per one electroelution tube for 5.5 h. Determination of protein concentration Protein concentration was determined by the method of Lowry et al. [28] using bovine serum albumin as the standard. Protein elution profiles from chromatographic columns were also monitored by measuring fractional absorbance at 280 nm. Enzyme assays Fe(III) reductase activity was determined according to a variant of the method by Dailey and Lascelles [25]. The 554 J. Mazoch et al. (Eur. J. Biochem. 271) Ó FEBS 2004 assay measures the formation of the Fe(II)(ferrozine)3 complex at 562 nm (absorption coefficient 28 mM )1 cm)1 ) in 25 mM Tris/HCl buffer, pH 7.4, 30 °C, with 0.8 mM ferrozine, 0.05 mM FMN and 0.2 mM Fe(III) complex. The reaction was started by the addition of 0.15 mM NADH. Chromate reductase activity was assayed at 30 °C in 0.5-mL reaction mixtures containing 25 mM Tris/HCl buffer, pH 7.4, 0.045 mM K2CrO4, 0.15 mM NADH, and 5­30 lL of enzyme preparation. Chromate concentration was quantified by adding samples to the reagent consisting of 0.1 M H2SO4 and 0.01% 1,5-diphenyl carbazide and measuring the absorbance at 540 nm [27]. Quinone reductase and flavin reductase activities were monitored by following the disappearance of the NADH absorbance at 340 nm in 25 mM Tris/HCl buffer, pH 7.4, 30 °C. Concentrations of electron acceptors were 100 lM for quinones when measuring quinone reductase and 50 lM for FMN in flavin reductase assay. Stock solutions of quinones were prepared as 5 or 10 mM in 20% acetone (v/v). Stopped-flow experiments A JASCO J-810 stopped-flow spectrophotometer with a dead time of 5.2 ms and a cell path length of 1.5 mm was used to measure redox reactions of Fe(III) complexes with chemically reduced FMN. A solution of 1.25 mM FMN in 25 mM Tris/HCl, pH 7.4, containing PtO2 (0.1 mgmL)1 ) as a catalyst [29] was made anaerobic with argon bubbling and then a stream of hydrogen gas was introduced to convert FMN into FMNH2. Following the sedimentation of the catalyst, the yellowish supernatant was placed in one syringe, and the second syringe was filled with a buffered solution of 1.6 mM ferrozine and 0.4 mM Fe(III) complexed with an appropriate ligand. After 1 : 1 mixing, changes in absorbance at 562 nm were recorded. Data from at least six repetitions were averaged and processed with the software package supplied with the instrument, giving the desired initial velocity values. Mass spectrometry The mass spectra of proteins were recorded on a Bruker Reflex IV mass spectrometer. Prior analysis, the samples were dialyzed against 10 mM Tris/HCl, pH 7.4, and then concentrated to a final value of about 1­10 lg of protein per lL using a Speed-Vac concentrator (Savant, Holbrook, USA).Onemicrolitereachofsamplewasmixedwith2 lLof matrix solution (ferulic acid, saturated in 50% acetonitrile, 1% trifluoroacetic acid). Aliquots (0.6 lL) were placed on the target and left to dry. The spectra were taken in positiveion linear mode. External mass calibration was performed using the molecular ions from the bovine insulin at 5734.5 Da and the horse myoglobin at 16952.6 Da 100 single shot spectra were accumulated in each mass spectrum. Gel electrophoresis One-dimensional SDS gel electrophoresis was carried out in 10­15% polyacrylamide gels [30], containing 0.1% SDS, using a Mini Protean II (Bio-Rad) vertical electrophoretic system. Staining was carried out using Coomassie brilliant blue R-250. Standard molecular mass markers were from Fluka. Non-denaturing electrophoresis was carried out in the same manner, but with omission of SDS from the gel running and loading buffers, and the sample was not pretreated under denaturing conditions. Staining was carried out using Coomassie blue R-250 or by zymogram analysis. The latter entailed overlay of the gel with 0.15 mM NADH and 0.8 mM ferrozine in 50 mM Tris/HCl buffer, pH 7.4, containing 0.05 mM FMN. Fe(III)nitrilotriacetic acid solution in the same buffer was added to the resulting concentration of 0.2 mM. Bands of Fe(III) reductase activity were detected as red zones against a slightly reddish background. Spectroscopic measurements Absorption spectra of the enzymes were taken with an Ultrospec 2000 UV/visible spectrophotometer (Pharmacia) using a 1-cm light path cell. Fluorescence spectra were obtainedusinganLS50Bspectrofluorimeter(PerkinElmer). Thin-layer chromatography analysis of flavins About 0.4 mg of the purified flavoprotein, dissolved in 0.1 mL of buffer, was mixed with 0.9 mL of methanol and the mixture was heated at 95 °C for 15 min. After cooling on ice and centrifugation at 12 000 g for 5 min, the supernatant was dried with a Speed-Vac concentrator. Water (10 lL) and methanol (10 lL) were added to the residue, and the solution was analyzed by TLC employing a cellulose gel plate (DC-Alufolien Cellulose, 0.1 mm thickness; Merck AG, Darmstadt, Germany) and the upper layer of an n-butyl alcohol/glacial acetic acid/water (4 : 1 : 5) mixture as the solvent phase. Methanol/water (1 : 1) solution of riboflavin, FMN and FAD were spotted as reference and the migration of the compounds were visualized with UV light. N-Terminal sequence analysis The highly purified enzymes were subjected to SDS/PAGE (15% polyacrylamide) and then electroblotted onto a poly(vinylidene difluoride) membrane (Bio-Rad). Selected bands were cut out of the Coomassie Blue-stained blots and analyzed by the Edman method with a 491 protein sequencer (Perkin-Elmer Applied Biosystems) according to the standard program (PL PVDF Protein). Homology searching and sequence alignments Homology searching against the databases was performed with the Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST) on NCBI Server (http://www.ncbi.nih.nlm.gov). Alignments of the sequences were produced using CLUSTAL W Multiple Sequence Alignment software on NPS@Server (http:// npsa-pbil.ibcp.fr). Kinetic data analysis Input data represented the mean values from at least three replicates. Nonlinear regression analysis was performed Ó FEBS 2004 P. denitrificans Fe(III) reductases (Eur. J. Biochem. 271) 555 with the kinetic software package EZ-FIT developed by Perrella [31]. Results Choice of a Fe(III) substrate for the enzyme assay Most of Fe(III) reductases have no known native substrates, but they exhibit a fairly weak specificity and can reduce many artificial Fe(III) complexes. Therefore, we explored a series of five compounds (Fe(III)EDTA, Fe(III)EGTA, Fe(III)nitrilotriacetic acid, Fe(maltol)3 and FeCl3) as potential artificial substrates for measuring the activity in cell-free extracts by the ferrozine assay. When no flavin was added exogenously, we found the following specific activities [nmol Fe(II)(ferrozine)3s)1 g protein)1 , means of three replicates]: 2, 151, 146, 16, 2, whereas with 50 lM FMN the respective values were: 5, 210, 392, 323, 83. These results told us that the Fe(III)nitrilotriacetic acid substrate together with FMN would best serve the purpose of activity measuring during enzymes purification. Contrary to some [8,13], but in accordance with other [10] previous research, our assay for the enzymes from P. denitrificans was not significantly sensitive to oxygen, as air removal from the reaction mixture with a stream of argon increased the rate of Fe(II)(ferrozine)3 production by 10% maximum. Based on this finding, all further measurements could be performed under ambient oxygen pressure. Purification of the Fe(III) reductases Preliminary experiments established that cultivation of P. denitrificans in a growth medium with limiting initial levels of Fe(III) citrate (0.5 lM instead of the normally used concentration of 30 lM) increased the specific activity of Fe(III) reductase in the cell-free extract about 1.5-fold. Accordingly, the enzyme was isolated from the irondeficient cells that had reached the stationary phase after aerobic growth. A summary of the data of the purification is given in Table 1 for a typical preparation. Aspects deserving comment are as follows: (i) Assay of the fractions in the HP-Sepharose Q elution profile identified two peaks of Fe(III) reductase activity, eluting at approximately 50­150 mM and 250­400 mM NaCl. They were termed ÔFerA and ÔFerB, respectively. Peak fractions were pooled separately and purification was continued for each pooled peak of activity. (ii) The presence of two Fe(III) reductases in cell-free exacts could also be directly demonstrated by native gel electrophoresis of the cell-free extracts followed by activity staining, which produced two bands with the intensity ratio of about 10 : 1. The more intense band corresponded to the enzyme with a higher electrophoretic mobility towards the anode. (iii) Preparative chromatofocusing proved to be an efficient purification step, which could be used twice for FerB, but not for FerA due to less resistance to pH changes. Chromatofocusing enabled us to determine isoelectric points of FerA and FerB as 6.9 and 5.5, respectively. These values are in accord with the observed chromatographic behavior of the enzymes at the Sepharose Q step. (iv) During optimization of the purification protocol the possibility of employing a hydrophobic interaction chromatography was also noticed. After loading the test sample on a Phenyl Superose column (Pharmacia) or on a HemaBio 1000 Phenyl column (Tessek, Prague) and applying a 1.5­0 M ammonium sulfate gradient, FerA was typically eluted at 80­90% of the gradient compared to FerB eluted at 45­50%. FerA thus seems to be considerably more hydrophobic than FerB. Determination of molecular mass SDS/PAGE analysis gave single Coomassie blue staining bands at a position of an approximate Mr of 18 000 for both the purified FerA and FerB (Fig. 1). These values were further refined by applying a MALDI-MS analysis, which revealed peaks at m/z 18 814 and 18 917 for FerA and at m/z 20 196 for FerB. We are currently unable to identify unequivocally the reason for the presence of two peaks in the spectrum of FerA. As the enzymes could be separated in a column of Superose 12, the same column was used to estimate their molecular sizes. By calibration of the column with standard proteins of known molecular masses, the molecular masses of native FerA and FerB were estimated as 25 kDa and Table 1. Purification of P. denitrificans Fe(III) reductases. The activity was determined following absorbance of Fe(II)(ferrozine)3 complex at 562 nm. Specific activity is expressed as enzyme activity per mg of total protein. Treatment Volume (mL) Total protein (mg) Total activity (nkat) Specific activity (nkatmg)1 ) Purification factor (-fold) Yield (%) FerA Cytosolic extract 25.5 517.4 120.3 0.23 1 100 Sepharose Q 2.8 7.81 59.1 7.57 32.9 49.13 Polybuffer exchanger 96 2.8 0.155 15.9 102.58 446 13.22 Superose 12 HR 10/30 4.0 0.028 9.17 327.50 1424 7.62 FerB Cytosolic extract 25.5 517.4 85.50 0.17 1 100 Sepharose Q 2.85 23.73 38.37 1.62 9.8 44.9 Polybuffer exchanger 74 1.5 0.434 16.47 37.93 230 19.3 Polybuffer exchanger 74 1.0 0.069 5.22 75.23 457 6.1 Superose 12 HR 10/30 0.6 0.024 2.25 93.89 568 2.6 556 J. Mazoch et al. (Eur. J. Biochem. 271) Ó FEBS 2004 55 kDa, respectively. From these results, we concluded that FerA exists in a monomeric form in the native state and that FerB has an oligomeric structure (a homodimer or, less probable, a homotrimer). N-Terminal sequence comparison The N-terminal amino acid sequences of FerA and FerB were determined and are presented in Fig. 2(A). A BLAST search revealed sequence similarity of 73% and 65% (sequence identity of 50% in both cases) of this region in FerB with chromate reductase from Pseudomonas putida and flavin reductase form Pseudomonas syringae (Fig. 2B), respectively. On the contrary, no significant similarity was found between the N-terminus of FerA and any known oxidoreductase. Spectral properties Measurement of the UV-visible absorption spectrum of FerA (about 95% pure, 0.04 mgmL)1 ) showed no chromophore uniquely attributable to this enzyme. On the other hand, the solution of FerB was yellowish in color and exhibited absorption bands at 380 and 448 nm (Fig. 3), diagnostic for the presence of a flavin group. When 0.4 mM NADH was added, the absorption peak at 448 nm disappeared, indicating a reducibility of the bound flavin by the physiological electron donor. The possession by FerB of a flavin cofactor was also apparent from the fluorescence Fig. 1. SDS/PAGE followed by silver staining. Lane 1, 10 lg protein of the starting cell-free extract; lane 2, 0.3 lg of purified FerA; lane 3, 1 lg of purified FerB; lane 4, molecular mass markers indicated (in kDa) on the right. Fig. 2. N-Terminal amino acid sequences of P. denitrificans FerA and FerB (A) and comparison of the N-terminal amino acid sequence of FerB with the sequences of other oxidoreductases (B). N-Terminal sequences were determined by Edman degradation. Multiple alignment of chosen sequences was performed using CLUSTAL W programme. Fre, flavin reductases of Pseudomonas syringae pv. syringae B728a (gi:23469150) and of P. syringae pv. tomato DC3000 (gi:28870863); CR, chromate reductase of Pseudomonas putida (gi:14209680); ?, a hypothetical protein (sequence derived from the known DNA sequence). Identical (w), strongly similar (:) and weakly similar (.) residues are indicated. Fig. 3. Absorption spectra of as isolated (--) and NADH reduced (---) FerB. The spectrum of FerB, 0.2 mg proteinmL)1 , were measured under aerobic conditions in 25 mM Tris/HCl buffer (pH 7.4), employing the buffer solution as a reference, with a light path of 1 cm. The reduced spectrum was obtained 5 min after the addition of 0.4 mM NADH. Ó FEBS 2004 P. denitrificans Fe(III) reductases (Eur. J. Biochem. 271) 557 spectrum where the enzyme excited at 446 nm shows a fluorescence emission with a maximum at 506 nm. Identification of the flavin moiety of FerB Exposure of FerB to heated methanol released a yellow soluble compound from the holoenzyme. Thin-layer chromatography of the methanol extract gave a single fluorescent spot with a Rf of 0.075. Under identical conditions, riboflavin, FMN and FAD exhibited Rf values of 0.40, 0.19 and 0.075, respectively. Thus, we concluded that FerB contains a noncovalently bound FAD. Substrate specificity In order to investigate the catalytic abilities of the isolated enzymes, a specificity study was undertaken with Fe(III)nitrilotriacetic acid and NADH as reference substrates. The rate of reduction of different Fe(III) compounds, under the conditions specified, is shown in Table 2. FerA has an absoluterequirementfortheflavinandcannoteffectively use NADPH as an electron donor in place of NADH. A substitution of riboflavin for FMN led to a decrease by 73% in the reaction rate (not shown in Table 2). Unlike FerA, FerB does not require exogenous flavin and utilizes both NADH and NADPH. Probably the most striking difference between FerA and FerB lies in the inability of the latter enzyme to reduce Fe(III) complexed by vicinal dihydroxy groups, as present in maltol, pyrocatechol and 2,3-dihydroxybenzoic acid. In line with this, we also observed that FerA, but not FerB, exhibited a reducing activity towards the complex of Fe(III) with a crude isolate of parabactin, the natural catecholic siderophore of P. denitrificans (data not shown). By monitoring the absorbance at 340 nm, we observed that the addition of FMN to FerA resulted in a significant rate of NADH oxidation also in the absence of Fe(III), which suggested the presence of an NADH : FMN oxidoreductase activity. Its value typically amounted to 330 nmol NADHs)1 mg protein)1 . For this reason we tested whether the reduction of Fe(III) could be due to the FMNH2 formed by FerA. This possibility gained support from the stopped-flow experiments in which we compared the rates of a direct nonenzymatic reduction of Fe(III) complexes by the chemically prepared FMNH2. The relative rate values presented in the last column of Table 2 match more closely those of FerA (r 0.92) rather than those for FerB (r 0.77), demonstrating that FerA indeed may act primarily as a flavin reductase, and, per se, not mediate the subsequent redox reactions of Fe(III). The identification of a sequence homology between FerB and chromate reductases (Fig. 2B) prompted an investigation of whether or not the Paracoccus enzyme can reduce chromate. The positive answer is conveyed by the results in Fig. 4, showing a significant speed-up in Table 2. Substrate specificity of Fe(III) reductases from P. denitrificans, compared with the chemical reactivity of FMNH2. Experimental details are described in the Material and methods section. The Fe(III) complexes were used at a final concentration of 0.2 mM. The relative reaction velocity for NADPH was related to that of NADH as 100%. The relative rates for the different Fe(III) complexes were related to that of Fe(III)nitrilotriacetic acid as 100%. The relative rate zero means a relative reaction velocity of > 0.1%. Substrate Relative rate of Fe(II)(ferrozine)3 complex formation FerA FerB No enzyme +50 lM FMN ­FMN +50 lM FMN FMNH2 NADH 100a 100b 100 ­ NADPH 0 82.3 69.0 ­ Fe(III)nitrilotriacetic acid 100a 100b 100 100c Fe(III)EGTA 125.5 54.2 54.9 106.4 Fe(III)EDTA 3.8 2.4 1.1 5.5 Fe(III)(maltol)3 91.4 3.9 3.1 83.1 FeCl3 29.0 0.7 0.7 ­ Fe(III)citrate 65.8 3.7 8.4 36.4 Fe(III)(pyrocat)3 37.3 0 0 13.0 Fe(III)(DHB)3 76.8 0 0 28.0 a 100% 2.04 10)7 mols)1 mg protein)1 ; b 100% 8.43 10)9 mols)1 mg protein)1 ; c 100% 3.73 10)5 Ms)1 . Fig. 4. Chromate reductase activity of FerB. Reaction mixture (0.5 mL) containing 0.045 mM chromate, 0.15 mM NADH and 25 mM Tris/HCl buffer, pH 7.4, with (d) or without (s) 5 lg of FerB were incubated at 30 °C. Aliquots were withdrawn at the indicated time intervals and analyzed for the concentration of chromate. 558 J. Mazoch et al. (Eur. J. Biochem. 271) Ó FEBS 2004 the reduction of chromate by NADH, caused by the presence of FerB. FerB also functioned as an efficient quinone reductase. For a series of four quinones, the relative activities were found as follows: 2,3-dimethoxy-5-methyl1,4-benzoquinone (ubiquinone-0), 100%; p-benzoquinone, 77%; menadione, 6%; duroquinone, 0.01% (100% 2.42 lmol NADHs)1 mg protein)1 ). The enzyme did not catalyze the oxidation of NADH by FMN at an appreciable rate (specific activity less than 1 nmol NADHs)1 mg protein)1 ). Kinetic studies of reactions catalyzed by FerA and FerB When studying the Fe(III) reductase reaction of FerA, there are effectively three compounds to be considered in a kinetic analysis: NADH, FMN and complexed Fe(III). Initial velocity studies were carried out by varying the concentrations of NADH in the presence of a series of concentrations of Fe(III)nitrilotriacetic acid while maintaining FMN at a constant concentration. As illustrated in Fig. 5(A), reciprocal plots are patterns of lines intersecting to the left of the vertical axis. The FMN reductase reaction of FerA was analyzed with NADH and FMN in the absence of Fe(III). Under these conditions, kinetic patterns similar to those found above were obtained (Fig. 5B). This behavior indicates a sequential mechanism with NADH and FMN as substrates. The results obtained on studying the Fe(III) reductase reaction of FerB are in Fig. 6. It can be seen that the reciprocal plot for NADH as variable substrate at a series of concentrations of Fe(III)nitrilotriacetic acid consists of a series of parallel lines. Kinetic patterns of this type occur in cases of ping-pong mechanisms. At the highest concentration of NADH the initial velocity of the enzyme turned out to be slower than that predicted by the hyperbolic law. Similar substrate inhibition was also observed in the 1/v vs. 1/[Fe(III)nitrilotriacetic acid] plot; this issue was, however, not pursued further at this stage. Table 3 lists values of the kinetic parameters for individual substrates, as estimated by computer fitting of velocity data of Figs 5 and 6 to the appropriate kinetic equations. Besides the data for Fe(III)nitrilotriacetic acid in Table 3, we also determined the kinetic parameters for some other Fe(III) complexes reducible by FerB. In the presence of a saturation concentration (0.15 mM) of NADH, the values of Km and kcat are: (0.4 0.2) mM and (0.91 0.02) s)1 for Fe(III)EGTA (1.6 0.8) mM and (0.16 0.03) s)1 for Fe(III)EDTA (0.4 0.2) mM and (0.08 0.01) s)1 for Fe(III)citrate, and (0.4 0.2) mM and (0.015 0.003) s)1 for Fe(III) chloride. The kinetics of the reduction of Fe(III) ligated with maltol could not be measured reliably due to the difficulty caused by an intensive coloration of the complex. The fact that all the obtained values Km are higher than 0.2 mM confirms that the measurements reported in Table 2 were performed under conditions of first-order Fig. 5. Initial-velocity kinetics of the reactions catalyzed by FerA. Measurements were performed with 0.2 lg FerA proteinmL)1 in 25 mM Tris/HCl buffer, pH 7.4 at 30 °C. (A) Fe(III) reductase reaction velocity as a function of NADH concentration in the presence of eight (s), 12 (d), 20 (h), 40 (j) and 67 (n) lM Fe(III)nitrilotriacetic acid at constant concentrations of FMN (50 lM) and ferrozine (0.8 mM). (B) Flavin reductase reaction velocity as a function of FMN concentration in the presence of 5 (s), 10 (d), 20 (h) and 30 (j) lM NADH. In this case both ferrozine and Fe(III)nitrilotriacetic acid were absent. Data are presented as double-reciprocal plots. Fig. 6. Initial-velocity kinetics of the Fe(III) reductase reaction catalyzed by FerB. Measurements were performed at 30 °C with 3 lg FerB proteinmL)1 in 25 mM Tris/HCl buffer, pH 7.4, containing 0.8 mM ferrozine. Reciprocal initial velocity is plotted against the reciprocals of NADH concentration at a series of fixed concentrations of Fe(III)nitrilotriacetic acid equal to 40 (s), 66.7 (d), 100 (n) and 200 (m) lM. Ó FEBS 2004 P. denitrificans Fe(III) reductases (Eur. J. Biochem. 271) 559 kinetics and hence the relative rates listed here, being proportional to the kcat/Km ratios, correctly express the substrate specificity of FerB. Discussion In this study, we have demonstrated a coexistence of two types of soluble Fe(III) reductases, FerA and FerB, in the soil bacterium Paracoccus denitrificans. Both enzymes are flavin-dependent, but in different ways: a flavin serves as a dissociable cosubstrate for FerA (a flavin reductase-type enzyme) and as a tightly bound redox-active cofactor of FerB (a flavoprotein-type enzyme). Flavin reductases are present in a variety of organisms [12]. Extensive studies have been conducted, for instance, with enzymes from E. coli [7,32] or luminous bacteria Vibrio harveyi [33­40] and Vibrio fischeri [41­44]. Although these enzymes catalyze similar reactions, they differ in respect to substrate specificities and reaction mechanisms. Accordingly, they can be classified into D, P and G types based on whether NADH, NADPH or both NADH and NADPH are utilized. Obviously, FerA falls into the D-type. Another classification criterion distinguishes between flavin reductases lacking a detectable prosthetic group and those having a noncovalently bound flavin cofactor. Considering the negative result of the spectroscopic search for a bound flavin group and the sequential kinetic pattern obtained (Fig. 5), we conclude that the first possibility applies, namely that FerA accelerates a direct redox reaction between NADH and a flavin. In this respect, it seems to be similar to the D-type flavin reductase of V. harveyi [35]. The observed substrate specificity of FerA (Table 2) adds to the previous appreciation of the biological role of a free reduced flavin as a reducing agent for Fe(III) [2,12,13,32] and broadens it to account for the reduction of the catecholtype Fe(III) complexes. The high effectiveness of the redox process mediated by free flavin is reflected by a low value of the apparent Michaelis constant for the Fe(III) complex with nitrilotriacetic acid (Table 3). In the case of FerB, the distinctive spectral features (Fig. 3) and the ping-pong kinetic patterns (Fig. 6) make it likely that the enzyme shuttles between the forms containing oxidized and reduced bound flavin during the catalytic cycle. The fact that FerB appears rather inefficient in reducing some substrates which are otherwise prone to uncatalyzed reactions with free FMNH2 (Table 2) suggests that the protein moiety contributes significantly to the observed substrate specificity. Although more direct information on the three-dimensional structure of FerB is obviously required before any firm conclusion can be drawn as to how this specificity is achieved, we can tentatively imagine two situations. In the first, the reduced flavin binds more tightly than the oxidized one, so that the cofactor becomes poorer electron donor and reactions of electron acceptors with low standard redox potentials are hampered. Our voltammetric measurements (unpublished results) have revealed that the Fe(III)/Fe(II) pairs complexed with maltol, pyrocatechol and dihydroxybenzoate, which do not accept electrons from FerB, have indeed the lowest standard redox potentials among the iron compounds listed in Table 2. Alternatively, FerB may carry a buried substrate binding cavity whose size allows for interaction with smaller electron acceptors like 1 : 1 Fe(III) complexes, chromate or quinones, but not with the rather bulky 1 : 3 Fe(III) complexes or exogenous free flavins. A survey of the literature indicates that FerB shares some biochemical properties with other enzymes. Its relatedness to the earlier described chromate reductase of Pseudomonas putida [27] is apparent from a match in the N-terminal sequence (Fig. 2B) and the ability to reduce chromate at a comparably high rate (Fig. 4). The subunit and native masses of FerB found here agree favorably with the values of 20 and 50 kDa reported before for Pseudomonas enzyme [27]. However, there is a marked difference in isoelectric points. While FerB is an acidic protein (pI 5.5 by chromatofocusing), pI of chromate reductase was claimed to be higher than 7.0 from chromatographic behavior; our own calculation based on the known amino acid sequence (gi:14209680) and exploiting the pI/Mw tool [45] on http:// www.expasy.org gave the value of 8.55. Unfortunately, the Pseudomonas enzyme was not tested for the presence of flavin nor the activity towards electron acceptors other than chromate, and hence a more detailed comparison with FerB cannot be presented at the moment. It may also be of interest to mention here the existence of the FAD-containing DT-diaphorase [46] and the FMN-containing flavinTable 3. Michaelis constants ( SE) for the substrates of FerA and FerB. Values were calculated from the data in Figs 5 and 6. The best fitting kinetic models, selected according to the Akaike's information criterion, correspond to a sequential bi­bi mechanism for FerA and to a ping-pong mechanism for FerB. Non-linear regression values of kcat are (14 1) s)1 and (28 6) s)1 for the Fe(III) reductase and FMN reductase activity of FerA, respectively, and (3.1 0.5) s)1 for FerB. Substrate (variable concentration) Second substrate (fixed concentrations) Third substrate (constant concentration) Km (lM) FerA NADH Fe(III)nitrilotriacetic acid FMN (50 lM) 5.5 0.7 Fe(III)nitrilotriacetic acid NADH FMN (50 lM) 17 2 NADHa FMN ­ 11 5 FMNa NADH ­ 20 8 FerB NADH Fe(III)nitrilotriacetic acid ­ 2.6 0.7 Fe(III)nitrilotriacetic acid NADH ­ 800 200 a Fe(II)(ferrozine)3 production was used to quantify reaction progress except in these cases where NADH oxidation by flavin was measured. 560 J. Mazoch et al. (Eur. J. Biochem. 271) Ó FEBS 2004 reductase [43,44] and nitroreductase [47] that resemble FerB in being homodimers of comparable molecular size, utilizing both NADH and NADPH as electron donors, exhibiting ping-pong kinetics and having a number of activities including that of quinone reductase. Indications exist that a quite small number of amino acid residues determine electron acceptor specificity of these enzymes. For example, a single point mutation was enough to convert NfsB, one of the oxygen-insensitive nitroreductases of Escherichia coli, to a highly active flavin reductase [48]. Constrains of similar type as in NfsB may exist in FerB and preclude in this way its reaction with free flavin. We hope that future comparative studies will clarify relationships (if any) between FerB and the other mentioned proteins on a molecular level. A part of this effort is currently aimed at the cloning of the gene for FerB for further characterization. Acknowledgements We thank Dr Z. Vobů rka (Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, AS CR, Prague) for performing N-terminal amino acid sequencing, Dr Z. Zdrá hal (Laboratory of Mass Spectrometry of Biomolecules, Faculty of Science, MU, Brno) for MALDI-MS analyses and Dr Z. Prokop (National Centre for Biomolecular Research, Faculty of Science, MU, Brno) for assisting us with the stopped-flow measurements. This work was supported by a grant from the Grant Agency of the Czech Republic to I. K. (203/01/1589) and partly by a contract from Ministry of Agriculture of the Czech Republic to J.T. (M-3-99-01). References 1. Schro¨ der, I., Johnson, E. & de Vries, S. (2003) Microbial ferric reductases. FEMS Microbiol. Rev. 27, 427­447. 2. Cowart, R.E. (2002) Reduction of iron by extracellular iron reductases: implications for microbial iron acquisition. Arch. Biochem. Biophys. 400, 273­281. 3. Jones, J.G., Gardner, S. & Simon, B.M. (1983) Bacterial reduction of ferric iron in a stratified eutrophic lake. J. Gen. Microbiol. 129, 131­139. 4. Short, K.A. & Blakemore, R.P. (1986) Iron respiration-driven proton translocation in aerobic bacteria. J. Bacteriol. 167, 729­ 731. 5. Dobbin, P.S., Warren, L.H., Cook, N.J., McEwan, A.G., Powell, A.K. & Richardson, D.J. (1996) Dissimilatory iron(III) reduction by Rhodobacter capsulatus. Microbiology 142, 765­774. 6. Moody, M.D. & Dailey, H.A. (1985) Ferric iron reductase of Rhodopseudomonas sphaeroides. J. Bacteriol. 163, 1120­1125. 7. Fontecave, M., Eliasson, R. & Reichard, P. (1987) NAD(P)H: flavin oxidoreductase of Escherichia coli. A ferric iron reductase participating in the generation of the free radical of ribonucleotide reductase. J. Biol. Chem. 262, 12325­12331. 8. Halle, F. & Meyer, J.-M. (1992) Ferrisiderophore reductases of Pseudomonas: purification, properties and cellular location of the Pseudomonas aeruginosa ferripyoverdine reductase. Eur. J. Biochem. 209, 613­620. 9. Mazoy, R. & Lemos, M.L. (1996) Ferric-reductase activities in whole cells and cell fractions of Vibrio (Listonella) anguillarum. Microbiol. 142, 3187­3193. 10. Mazoy, R., Lopez, E.M., Fouz, B., Amaro, C. & Lemos, M.L. (1999) Ferric-reductase activities in Vibrio vulnificus biotypes 1 and 2. FEMS Microbiol. Lett. 172, 205­211. 11. Vadas, A., Monbouquette, H.G., Johnson, E. & Schro¨ der, I. (1999) Identification and characterization of a novel ferric reductase from the hyperthermophilic archaeon Archaeoglobus fulgidus. J. Biol. Chem. 274, 36715­36721. 12. Fontecave, M., Coves, J. & Pierre, J.-L. (1994) Ferric reductases or flavin reductases? Biometals 7, 3­8. 13. Coves, J. & Fontecave, M. (1993) Reduction and mobilization of iron by a NAD(P)H: flavin oxidoreductase from Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 211, 635­641. 14. Myers, C.R. & Myers, J.M. (1997) Outer membrane cytochromes of Shewanella putrefaciens MR-1: spectral analysis, and purification of the 83-kDa c-type cytochrome. Biochim. Biophys. Acta 1326, 307­318. 15. Seeliger, S., Cord-Ruwisch, R. & Schink, B. (1998) A periplasmic and extracellular c-type cytochrome of Geobacter sulfurreductans acts as a ferric ion reductase and as an electron carrier to other acceptors or to partner bacteria. J. Bacteriol. 180, 3686­3691. 16. Shatwell, K.P., Dancis, A., Cross, A.R., Klausner, R.D. & Segal, A.W. (1996) The FRE1 ferric reductase of Saccharomyces cerevisiae is a cytochrome b similar to that of NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 271, 14240­14244. 17. Coves, J., Eschenbrenner, M. & Fontecave, M. (1993) Sulfite reductase of Escherichia coli is a ferrisiderophore reductase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 192, 1403­1408. 18. Lee, P.L., Halloran, C., Cross, A.R. & Beutler, E. (2000) NADHferric reductase activity associated with dihydropteridine reductase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 271, 788­795. 19. Sapshead, L.M. & Wimpenny, J.W.T. (1972) The influence of oxygen and nitrate on the formation of the cytochrome pigments of the aerobic and the anaerobic respiratory chain of Micrococcus denitrificans. Biochim. Biophys. Acta 267, 388­397. 20. Bosma, G., Braster, M., Stouthamer, A.H. & van Verseveld, H.W. (1987) Subfractionation and characterization of soluble c-type cytochromes from Paracoccus denitrificans cultured under various limitingconditionsinthechemostat.Eur.J.Biochem.165,665­670. 21. Tait, G.H. (1975) The identification and biosynthesis of siderochromes formed by Micrococcus denitrificans. Biochem. J. 146, 191­204. 22. Bergeron, R.J., Dionis, J.B., Elliott, G.T. & Kline, S.J. (1985) Mechanism and stereospecificity of the parabactin-mediated irontransport system in Paracoccus denitrificans. J. Biol. Chem. 260, 7936­7944. 23. Bergeron, R.J., Weimar, W.R. & Dionis, J.B. (1988) Demonstration of ferric 1-parabactin-binding activity in the outer membrane of Paracoccus denitrificans. J. Bacteriol. 170, 3711­3717. 24. Bergeron, R.J. & Weimar, W.R. (1990) Kinetics of iron acquisition from ferric siderophores by Paracoccus denitrificans. J. Bacteriol. 172, 2650­2657. 25. Dailey, H.A. Jr & Lascelles, J. (1977) Reduction of iron and synthesis of protoheme by Spirillum itersonii and other organisms. J. Bacteriol. 129, 815­820. 26. Kucera, I. & Matchova, I. (1997) Iron as a possible mediator of the oxic-to-anoxic transition in Paracoccus denitrificans. Biochem. Mol. Biol. Int. 43, 305­310. 27. Park, C.H., Keyhan, M., Wielinga, B., Fendorf, S. & Matin, A. (2000) Purification to homogeneity and characterization of a novel Pseudomonas putida chromate reductase. Appl. Environ. Microbiol. 66, 1788­1795. 28. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. & Randall, R.J. (1951) Protein measurement with the folin-phenol reagents. J. Biol. Chem. 193, 265­275. 29. Halle, F. & Meyer, J.-M. (1992) Iron release from ferrisiderophores. A multi-step mechanism involving a NADH/FMN oxidoreductase and a chemical reduction by FMNH2. Eur. J. Biochem. 209, 621­627. 30. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680­685. Ó FEBS 2004 P. denitrificans Fe(III) reductases (Eur. J. Biochem. 271) 561 31. Perrella, F.W. (1988) EZ-FIT: a practical curve-fitting microcomputer program for the analysis of enzyme kinetic data on IBM-PC compatible computers. Anal. Biochem. 174, 437­447. 32. Fieschi, F., Niviere, V., Frier, C., Decout, J.-L. & Fontecave, M. (1995) The mechanism and substrate specificity of the NADPH: flavin oxidoreductase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 270, 30392­30400. 33. Michaliszyn, G.A., Wing, S.S. & Meighen, E.A. (1977) Purification and properties of a NAD(P)H: flavin oxidoreductase from the luminous bacterium, Beneckea harveyi. J. Biol. Chem. 252, 7495­7498. 34. Jablonski, E. & DeLuca, M. (1977) Purification and properties of the NADH and NADPH specific FMN oxidoreductases from Beneckea harveyi. Biochemistry 16, 2932­2936. 35. Jablonski, E. & DeLuca, M. (1978) Studies of the control of luminiscence in Beneckea harveyi: properties of the NADH and NADPH: flavin oxidoreductases. Biochemistry 17, 672­678. 36. Lei, B., Liu, M., Huang, S. & Tu, S.-C. (1994) Vibrio harveyi NADPH-flavin oxidoreductase: Cloning, sequencing and overexpression of the gene and purification and characterization of the cloned enzyme. J. Bacteriol. 176, 3552­3558. 37. Tanner, J.J., Lei, B., Tu, S.-C. & Krause, K.L. (1996) Flavin reductase P: Structure of a dimeric enzyme that reduces flavin. Biochemistry 35, 13531­13539. 38. Liu, M., Lei, B., Ding, Q., Lee, J.C. & Tu, S.-C. (1997) Vibrio harveyi NADPH: FMN oxidoreductase: preparation and characterization of the apoenzyme and monomer-dimer equilibrium. Arch. Biochem. Biophys. 337, 89­95. 39. Lei, B. & Tu, S.-C. (1998) Mechanism of reduced flavin transfer from Vibrio harveyi NADPH-FMN oxidoreductase to luciferase. Biochemistry 37, 14623­14629. 40. Wang, H., Lei, B. & Tu, S.-C. (2000) Vibrio harveyi NADPHFMN oxidoreductase Arg203 as a critical residue for NADPH recognition and binding. Biochemistry 39, 7813­7819. 41. Tu, S.-C., Becvar, J.E. & Hastings, J.W. (1979) Kinetic studies on the mechanism of bacterial NAD(P)H: flavin oxidoreductase. Arch. Biochem. Biophys. 198, 110­116. 42. Zenno, S., Saigo, K., Kanoh, H. & Inouye, S. (1994) Identification of the gene encoding the major NAD(P)H-flavin oxidoreductase of the bioluminescent bacterium Vibrio fischeri ATCC 7744. J. Bacteriol. 176, 3536­3543. 43. Inouye, S. (1994) NAD(P)H-flavin oxidoreductase from the bioluminiscent bacterium, Vibrio fischeri ATCC 7744, is a flavoprotein. FEBS Lett. 347, 163­168. 44. Koike, H., Sasaki, H., Kobori, T., Zenno, S., Saigo, K., Murphy, M.E.P., Adman, E.T. & Tanokura, M. (1998) 1.8 A° crystal structure of the major NAD (P) H: FMN oxidoreductase of a bioluminiscent bacterium, Vibrio fischeri: overall structure, cofactor and substrate-analog binding, and comparison with related flavoproteins. J. Mol. Biol. 280, 259­273. 45. Bjellqvist, B., Hughes, G.J., Pasquali, Ch, Paquet, N., Ravier, F., Sanchez, J.-Ch, Frutiger, S. & Hochstrasser, D.F. (1993) The focusing positions of polypeptides in immobilized pH gradients can be predicted from their amino acid sequences. Electrophoresis 14, 1023­1031. 46. Ernster, L. (1987) DT-diaphorase: a historical review. Chem. Scripta 27A, 1­13. 47. Zenno, S., Koike, H., Tonokura, M. & Saigo, K. (1996) Gene cloning, purification, and characterization of NfsB, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from Escherichia coli, similar in properties to FRase I, the major flavin reductase of Vibrio fischeri. J. Biochem. (Tokyo) 120, 736­744. 48. Zenno, S., Koike, H., Tonokura, M. & Saigo, K. (1996) Conversion of NfsB, a minor Escherichia coli nitroreductase, to a flavin reductase similar in biochemical properties to FRase I, the major flavin reductase in Vibrio fischeri, by a single amino acid substitution. J. Bacteriol. 178, 4731­4733. 562 J. Mazoch et al. (Eur. J. Biochem. 271) Ó FEBS 2004 Available online at www.sciencedirect.com Vaccine 25 (2007) 7948­7954 A correlation of in vitro tests for the immune response detection: A bovine trichophytosis model Martin Faldynaa,, Eva Oborilovab, Josef Krejcia, Radek Tesarika, Eva Krejcic, Barbora Pavlovaa,d, Alois Rybnikarb a Veterinary Research Institute, Brno, Czech Republic b Bioveta Plc., Ivanovice na Hane, Czech Republic c Institute of Public Health, Ostrava, Czech Republic d Masaryk University, Brno, Czech Republic Received 26 October 2005; received in revised form 20 August 2007; accepted 2 September 2007 Available online 25 September 2007 Abstract The aim of our study was to extend knowledge about possibilities of replacing challenge tests by in vitro methods in cattle on the model of trichophytosis. We correlated results of three in vitro tests for the detection of immune response, i.e. a specific antigen-driven lymphocyte transformation test measured by 3 H-thymidine incorporation, specific antigen-induced production of interferon-gamma and detection of IgG1 and IgG2 isotypes of specific antibodies, in calves vaccinated against the disease or challenged with Trichophyton verrucosum as causative agent. The results obtained in the present study by different methods are correlated together. Lymphocyte transformation test correlated positively with interferon-gamma production. Ratio of IgG1 to IgG2 isotypes of antibody correlated negatively with both cell-mediated methods. Moreover the results show that any of the methods might in future replace the in vivo challenge tests that are still conventionally used for testing of newly developed vaccines. 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved. Keywords: Trichophytosis; Cattle; Challenge; Immunity; Vaccine; Interferon-gamma 1. Introduction At present, a high pressure has been imposed upon investigators to abide the principles of 3Rs concerning the use of animals for experimental purposes including testing new techniques or methods for prevention of infectious diseases. These principles have been summarized for the first time in 1959 in the book published by Russell and Burch [1]; these include replacement, reduction, and refinement. These principles become inseparable from laws that must be followed by investigators using animals for experimental purposes. Therefore, the aim of our study presented here was to extend knowledge about possibilities of replacing Corresponding author at: Hudcova 70, 621 00 Brno, Czech Republic. Tel.: +420 53333 1301; fax: +420 5 4121 1229. E-mail address: faldyna@vri.cz (M. Faldyna). challenge tests by in vitro methods in cattle on the model of trichophytosis. Trichophytosis, or ringworm, caused by dermatophyte Trichophyton verrucosum Bodin 1902 (T. verrucosum) is the most common mycosis in cattle [2,3]. The rise of protective immunity against this disease was found after natural or experimental infection [4] and also after administration of some vaccines [5,6]. It seems that only live vaccines that mimic natural infection lead to fully protective immunity [7]. It is obvious that the cell-mediated part of the immune response must be stimulated in order to acquire sufficient immunity against ringworm [7]. The role of specific antibodies is not clear. Although one study indicated that combination of cell-mediated and humoral responses is necessary for clarification of the infection [8], another one described that colostrum-derived antibodies did not protect calves against the infection [9]. The levels of the post-infection or post-vaccination immunity in calves were 0264-410X/$ ­ see front matter 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved. doi:10.1016/j.vaccine.2007.09.021 M. Faldyna et al. / Vaccine 25 (2007) 7948­7954 7949 investigated by several authors using in vivo or in vitro methods [10­12]. In our study, we correlated results of three in vitro tests for the detection of immune response, i.e. a specific antigen-driven lymphocyte transformation test measured by 3H-thymidine incorporation, specific antigen-induced production of interferon-gamma and detection of specific antibodies, with the results obtained in vivo by challenge. From this point of view, we also correlated intensity of immune response developed after introduction of a live vaccine with level of immune response developed after recovery from experimental infection. 2. Materials and methods 2.1. Animals and experimental design Totally 12 calves of Holstein breed (aged 12­56 days) from breeding facilities without the incidence of trichophytosis were allocated into two groups. Six animals of the group 1 were twice intramuscularly vaccinated using a prophylactic dose (i.e. 2.5 ml) of the live freeze-dried commercial vaccine against ringworm in cattle (Trichoben inj. sicc. ad us. vet., Bioveta Plc., Czech Republic) containing 3.16 × 106 CFU of live T. verrucosum strain per ml according to manufacturer (hereafter called vaccinated calves). The interval between vaccination and revaccination was 13 days. Six other calves ­ group 2 ­ were left as a nonvaccinated control (hereafter called non-vaccinated calves). Blood samples for in vitro laboratory analyses of a postvaccination immunity were taken from all calves 50 days after revaccination. At the same day, all calves were challenged to prove the protective immunity induced by the vaccination. The challenge was performed epicutaneously onto the sheared and gently scarified skin by virulent T. verrucosum CCM F-650 culture in dose 100,000 CFU per calf by the same way as described earlier [13]. The clinical symptoms of mycotic disease in experimental animals were monitored for 55 days after the day of inoculation and samples from the positive skin lesions of calves during whole experiment were cultured on Sabourauďs agar containing actidione and chloramphenicol [14]. Results can be summarized as follows: the vaccinated calves from group 1 developed a satisfactory level of post-vaccination immunity, which fully protected them from experimental infection with T. verrucosum strain. After challenge, these animals were either without clinical skin trichophytic changes (five calves) or with only minute ones, superficial in character (scales or papullae) and of a short duration (one calf with minute skin changes presented for 6 days). Contrary to that, all non-vaccinated control calves (group 2) given the same challenge dose developed clinical trichophytosis showing extensive clinical skin trichophytic lesions persisting for 34 days. Thirteen days after recovery from experimental infection, blood samples from calves of the group 2, i.e. non-vaccinated group, were taken to detect a post-infection immunity (hereafter called challenged calves). These animals were challenged for the second time with dose 240,000 CFU per animal.Thechallengewasperformedthesamewaydescribed above. Based on its results, the degree of post-infection immunity after recovery from the first experimental infection in these calves was the same as the level of immunity at re-vaccinated calves. 2.2. Preparation and characterization of antigens for in vitro tests Two different antigens were prepared from the cells of T. verrucosum CCM F-765 for in vitro tests. The antigens were TV-H and TV-S with higher proportion of hyphae and spores, respectively. The strain was cultured on solid media (Sabourauďs agar and malt agar in the case of antigen TV-H and TV-S, respectively) for 15 days at 26 C. The cultures were homogenized in 0.8% solution of sodium chloride, lyophilized and than inactivated by -irradiation. Before lyophilization, hyphae were removed from the culture suspension of TV-S antigen by repeated filtration. The antigens were characterized by microscopy, analysis of fatty acids, total protein content (BCATM Protein Assay Kit from Pierce, France used according to manufacturer's recommendations) and protein electrophoresis on polyacrylamide gel with natrium-dodecylsulphate by the method of Laemmli [15] and stained with silver by the method of Rabilloud et al. [16]. Light microscopy showed that both antigens consisted of fungal hyphae and microconidia, including occasional macroconidia. They above all differed from each other in the proportion of number of hyphae:number of microconidia. Hyphae predominated in TV-H antigen (the proportion was 4.4:1). On the contrary, the proportion was 1:46.1 in favour of the number of microconidia in TV-S antigen. Fatty acid analysis was done using Microbial Identification System [MIS] Sherlock (MIDI Inc., Newark, DE, USA). The whole-cell fatty acid methylesters (FAME) were prepared from both antigens dry biomass (the weight of 0.04 g per sample was used; three determinations per antigen were performed). Saponification, methylation and extraction were performed according to the producer's manual--MIS Sherlock operating manual [17]. The obtained FAME profiles of antigens were compared with FAME profiles of microorganisms presented in standard database FUNGI (version 3.80, MIDI Inc.). MIS index was used to express the closeness of a match of the FAME profile to a library entry. Unsaturated and saturated fatty acids were recognized as the major fatty acids of antigens TV-H and TV-S. Fatty acid composition of both antigens significantly differed. It was evident primarily in total percentage of saturated fatty acids (23.7% in TV-H antigen; 31.9% in TV-S antigen) and unsat- 7950 M. Faldyna et al. / Vaccine 25 (2007) 7948­7954 urated fatty acids (71.5% in TV-H antigen; 61.4% in TV-S antigen). Comparing individual fatty acids presented, the most apparent was difference in saturated fatty acid C18:0 (1.6% in TV-H, 8% in TV-S) and unsaturated fatty acid C18:2 6,9c (65.9% in TV-H, 51.7% in TV-S). The presence of hydroxy fatty acids also varied (2.1% in TV-H, 0.9% in TV-S); fatty acid alcohols were detected only in antigen TV-S (1.9%). Basedoncomparisonwithentriesinthestandarddatabase, FAME profiles of both antigens were most similar to T. verrucosum. Antigen TV-H was recognized as the "atypical strain" of T. verrucosum (showed MIS index 0.266 on average). For the antigen TV-S no result was found by standard matching rules. Regardless of that, T. verrucosum was again assessed as the closest match. Using the BCATM kit, total protein content was 0.6 and 0.8 mg/ml for TV-H and TV-S, respectively. By electrophoresis, TV-S and TV-H were divided into 10 and 13 bands, respectively, from 33 to 114 kDa. The antigen TV-H differed from TV-S by presence of four additional bands: 35­36 kDa, 55­56 kDa, 68­69 kDa, and 98­100 kDa. Contrary to that, TV-S contained one dim band of 53­54 kDa. 2.3. Specific antigen-driven lymphocyte transformation test Peripheral blood mononuclear cells for the transformation assay were separated from whole blood by 1.077 g per litre density gradient centrifugation (Histopaque-1077, Sigma­Aldrich), and their activity was assessed after stimulation with specific antigens. Density of the cell suspension was adjusted to 106 ml-1 of RPMI 1640 culture medium (Sigma), supplemented with 10% precolostral calf serum, antibiotics(100,000 IUofpenicillinand0.2 gofstreptomycin per litre), and mercaptoethanol (Fluka, Switzerland; 3.4 l of 1000 times diluted solution into 1 ml of the cell suspension). Two hundred microlitres of each cell suspension was dispensed in triplicates into the 96-well P-type microtitre plates (Gama, Ceske Budejovice, Czech Republic) and incubated at 37 C, in the atmosphere of 5% CO2 in air for a total of 5 days. Twenty microlitres of the specific antigens (0.2 mg/ml) were added into appropriate wells. Twenty hours before harvesting (FilterMate Harvestor, Packard Bioscience Company), 50 l of medium with 3H-thymidine (5 Ci/ml) was added. The incorporation of 3H-thymidine was analyzed by a microplate scintillation and luminescence counter (TopCount NXTTM, Packard Bioscience Company). The results were expressed in terms of stimulation indices calculated as the ratio of the activities of stimulated to non-stimulated cells. 2.4. Specific antigen-induced production of interferon-gamma For the detection of interferon-gamma production, three aliquots of 1 ml of heparinized whole blood were incubated without antigens (control) or with specific antigens (50 l of 0.1 mg/ml solutions) for 20 h at 37 C. Samples of plasma were collected and stored at -18 C until analyzed. Interferon-gamma was detected with a commercial sandwich enzyme immunoassay kit (Bovigam, CSL, Victoria, Australia) according to the manufacturer's recommendations. Absorbances were read at 450 nm using the multichannel spectrometer iEMS Reader (Labsystems, Helsinki, Finland). 2.5. Detection of specific antibodies The antigens dissolved in carbonate buffer, pH 8.6, were dispensed into the wells (0.3 g per well) of 96well polystyrene microtitre plates (Gama, Ceske Budejovice, Czech Republic). The plates were incubated at room temperature for 1 h and subsequently rinsed three times with PBS, pH 7.2, containing 0.05% Tween 20. Then 100 l of diluting solution (PBS, pH 7.2, containing 0.05% Tween 20 and 0.5% casein hydrolysate) was dispensed into each well. The wells in the first row were completed with 50 l blood serum samples pre-diluted 1:33, and threefold dilution series were prepared transferring 50 l of the mixture into 100 l of diluting solution. After 60 min of incubation in a humid chamber at 37 C, the wells were rinsed three times and 100 l of sheep anti-bovine IgG, IgG1 and IgG2 horse radish peroxidaselabelled conjugate (Bethyl Laboraties, Montgomery, TX) diluted 1:5000 was added into respective wells. After another 2 h of incubation at room temperature, the plates were rinsed four times and 100 l substrate + chromogen TMB mixture (Test-line, Czech Republic) was added into each well. The reaction was stopped after 15-min incubation by adding 50 l 2 M sulphuric acid, and absorbances were read at 450 nm using the multichannel spectrometer iEMS Reader (Labsystems, Helsinki, Finland). These measurements yielded titration curves for respective serum samples. The resulting titre was defined as the dilution at which the optical density decreased to the endpoint value (OD450 = 0.1). 2.6. Statistical analysis Data are presented as individual results. For evaluation of between-group differences in the in vitro tests, nonparametric tests were used. For characterization of post-vaccination immunity, calves of group 1 and group 2 before challenge were compared using the Mann­Whitney U-test. For characterization of post-infection immunity, calves of group 2 before and after challenge were compared using the Wilcoxon nonparametric matched pairs test. For detection of differences between post-vaccination and post-infection immunity, calves of group 1 and group 2 after challenge were compared using the Mann­Whitney U-test. Correlation of results obtained by different in vitro tests was assessed with Spearman nonparametric correlation test. All calculations were performed with Prizma (Graph Pad Software Inc.) software. M. Faldyna et al. / Vaccine 25 (2007) 7948­7954 7951 3. Results 3.1. Specific antigen-driven lymphocyte transformation test The ability of peripheral blood mononuclear cells to respond to specific antigens was significantly higher (p < 0.05 for TV-H and p < 0.01 for TV-S) in vaccinated calves than in non-vaccinated ones. Mean stimulating indices in vaccinated calves were 6.3 and 10.4 for TV-H and TV-S, respectively. Contrary to that, stimulating indices in non-vaccinated calves were 1.8 and 1.6 for TV-H and TV-S, respectively. In these calves, indices increased after recovery from experimental infection to 7.9 and 15.4 for TV-H and TV-S, respectively (p < 0.05 for both antigens). There was no statistical difference between vaccinated and challenged calves. When the difference between antigens was evaluated in the same animals, the response to TV-S was significantly higher (p < 0.05) in challenged calves. 3.2. Specific antigen-induced production of interferon-gamma Vaccinated animals were able to release significantly higher amounts of interferon-gamma when compared to nonvaccinated ones (p < 0.01 for both antigens). Mean ratios in vaccinated calves were 3.6 and 3.0 for TV-H and TVS, respectively. Contrary to that, ratios were 1.3 and 1.0 in non-vaccinated calves. In these calves, the ratios increased after recovery from experimental infection to 2.8 and 2.7 for TV-H and TV-S, respectively (p < 0.05 for both antigens). There was no statistical difference between vaccinated and challenged calves. When the difference between antigens was evaluated in the same animals, the response to TV-S was significantly lower (p < 0.05) in vaccinated animals. 3.3. Detection of specific antibodies Serum of vaccinated calves contained significantly higher amounts of antigen-specific antibodies when compared to non-vaccinated ones (p < 0.01 for both antigens). Mean titres in vaccinated calves were 2176 and 1262 for TV-H and TV-S, respectively. Contrary to that, titres in non-vaccinated calves were 244 and 156 for TV-H and TV-S, respectively. In these calves, titres increased after recovery from experimental infection to 417 and 862 for TV-H and TV-S, respectively (p < 0.05 for both antigens). There was no statistical difference between vaccinated and challenged calves in the case of TV-S antigen. In the case of TV-H antigen, the difference was significant (p < 0.01). Contrary to other in vitro parameters, there was no significant difference between the antigens in the same animals. The IgG1/IgG2 ratio of antigen-specific antibodies was significantly lower in serum of vaccinated calves when compared to non-vaccinated ones (p < 0.01 for both antigens). Mean ratios in vaccinated calves were 6.3 and 73.0 for TV-H and TV-S, respectively. Contrary to that, ratios in nonvaccinated calves were 257.0 and 423.0 for TV-H and TV-S, respectively. In these calves, the ratios decreased after recovery from experimental infection to 13.2 and 16.5 for TV-H andTV-S,respectively(p < 0.05forbothantigens).Therewas no statistical difference between vaccinated and challenged calves. When the difference between antigens was evaluated in the same animals, IgG1/IgG2 ratio of TV-H-specific antibodies was significantly lower (p < 0.05) in vaccinated calves. 3.4. Correlation of results of the in vitro tests All individual results obtained in the study are shown as XY dot-plots in Fig. 1. When the results obtained by the lymphocyte transformation test were correlated with the results obtained by the detection of interferon-gamma release using the nonparametric Spearman correlation test, positive correlation (r = 0.6334, p = 0.0048 and r = 0.7260, p = 0.0006 for TV-H and TV-S antigen, respectively) was found. Contrary to that, when IgG1/IgG2 ratios were correlated with the cellular test, negative correlations were found. In the case of TV-H antigen, r = -0.3907, p = 0.1089 and r = -0.5490, p = 0.0210 were found for the results of lymphocyte transformation test and release of interferon-gamma, respectively. In the case of TV-S antigen, r = -0.8176, p < 0.0001 and r = -0.5493, p = 0.0182 were obtained for the results of lymphocyte transformation test and release of interferon-gamma, respectively. 4. Discussion The purpose of our study was to extend knowledge about possibilities of replacing challenge tests by in vitro methods in cattle. In order to be able to replace experimental infections of animals for testing of vaccines and/or vaccination procedures, it is necessary to know what kind of immune response is responsible for protectivity. In the case of bovine trichophytosis, it is accepted that protectivity against the disease is dependent on the cell-mediated immunity associated with interferon-gamma production [7]. Therefore we correlated three in vitro tests for the detection of immune response: (1) a specific antigen-driven lymphocyte transformation test measured by 3H-thymidine incorporation as a golden standard, (2) a specific antigen-induced production of interferon-gamma and (3) detection of subisotype of specific antibodies by ELISA as a method accessible in many laboratories. Immunoprophylaxis of trichophytosis in cattle using specific vaccines was introduced into veterinary practice more than 30 years ago [5,18]. The best results in the control of the disease were obtained using live vaccines, including vaccine used in our study [7,19­24]. 7952 M. Faldyna et al. / Vaccine 25 (2007) 7948­7954 Fig. 1. Correlation of results of the in vitro tests for detection of acquired immunity against trichophytosis of cattle. Data are shown as individual results and lines of trend are presented. For in vitro detection, two different antigens (as described in the Section 2) were used with higher proportion of hyphae (left column) and spores (right column), respectively. Laboratory in vitro tests used in the present study confirmed capability of the vaccine Trichoben to stimulate the immune system of vaccinated animals. These produced high amounts of antigen-specific T-lymphocytes able of a cell proliferation and an interferon-gamma production after the in vitro stimulation with a proper antigen. That finding is in concord with previous studies dealing with cell-mediated immunity after vaccination of cattle using other vaccines [25]. Moreover, no statistically significant differences were found between these two parameters in post-vaccination and post-infection immunity. It clearly proved that immunity developed after administration of live vaccine is similar to that developed after recovery from experimental infection. Furthermore, significant positive correlations were found for the results of these two tests. Although data obtained by lymphocyte transformation test do not give information about the cell populations activated in the test, the results acquired in our study correlated well with results of interferon-gamma production. These data confirmed that pro-inflammatory, i.e. Th1, type of immune response is necessary for recovery from trichophytic infection. Antigen-specific antibodies were produced after both vaccination and recovery from experimental infection. It is noteworthy that total titres of post-vaccination antibodies, particularly titres against TV-H antigen, were higher than titres of post-infection antibodies. Nevertheless, high levels of IgG2 antibodies were produced in both cases; a statistically significant decrease in the ratio between specific antibodies of the two tested isotypes (i.e. IgG1 and IgG2) reflected that fact. Humoral immune response regulation is a multifactorial process comprising proper activation, co-stimulation and participation of cytokines. Cytokines are essential for optimal isotype switch and for production of various subisotypes of antibodies during the antigen-specific immune response. In M. Faldyna et al. / Vaccine 25 (2007) 7948­7954 7953 vitro study with purified bovine B-lymphocytes demonstrated that IgG2 production was positively regulated by IFN- , whilst IgG1 and IgE production was positively driven by IL4 [26,27]. Furthermore, IgG1 is the major antibody isotype secreted with colostrum; that is subsequently absorbed into calf serum [28]. That fact can explain that IgG1 antibodies considerablyprevailinserumofnon-vaccinatedcalves.However, this titre was negligible in comparison with that obtained after the stimulation of antibody response, particularly after vaccination. Although there is no information about the role of phagocytosis in protection against the cutaneous mycotic infection in cattle, it should be noted here that IgG2 is the principal antibody isotype capable of opsonization in cattle [29]. The intensities of specific antibody production after vaccination and after recovery from experimental infection were distinct and comparison of two antigens used in the in vitro studies showed statistically significant differences between them. That can be explained by different routes of antigen introduction--intramuscular and epicutaneous administration in the cases of vaccination and infection, respectively. It follows that the antigen was presented to the immune system in a little different way. Moreover, previous studies in guinea pigs showed that the vaccination strain was eliminated from the site of inoculation within several days [30], whilst in the present study, the pathogen was present at the site of epicutaneous administration for more than 40 days. The results obtained in the present study show that some of the in vitro methods for the detection of immune response might in future ­ after their validation and standardization ­ replace the in vivo challenge tests that are still conventionally used for testing of newly developed vaccines. Acknowledgements Authors would like to thank Mrs. Lenka Leva, Eva Kotlarova and Hana Kudlackova for their excellent technical assistance and Mrs. Ludmila Faldikova for her help with manuscript preparation. This study was supported by the Ministry of Agriculture of the Czech Republic (MZE 0002716201 and 1B44024). References [1] Russel WMS, Burch RL. The principle of humane experimental technique. London: Methuen; 1959, 238 p. [2] Stenwig H. Isolation of dermatophytes from domestic animals in Norway. Nor Vet Med 1985;37(3):161­9. [3] Connole MD. Review of animal mycoses in Australia. Mycopathologia 1990;111(3):133­64. [4] Weigl E. Immunology in dermatophytoses. Cesk Epidemiol Mikrobiol Imunol 1987;36(5):308­19 [in Czech]. [5] Sarkisov AC, Kolesnikov AY. The main measures of dermatomycosis eradication. Veterinarija (Moscow) 1989;(12):36­8 [in Russian]. [6] Rybnik´aˇr A, Chumela J, Vrzal V, Krupka V. Immunity in cattle vaccinated against ringworm. Mycoses 1991;34(9­10):433­6. [7] Gudding R, Lund A. Immunoprophylaxis of bovine dermatophytosis. Can Vet J 1995;36(5):302­6. [8] Pier AC, Ellis JA, Mills KW. Development of immune response to experimental bovine Trichophyton verrucosum infection. Vet Dermatol 1993;3(3):131­8. [9] Rybnik´aˇr A, Chumela J, Vrzal V. Immunisation of pregnant cows against ringworm and its effect on the progeny. Acta Vet Brno 2001;70(4):421­3. [10] WawrzkiewiczK,WawrzkiewiczJ.Immunogeniccharacteristicsoflive and inactivated vaccines against trichophytosis of cattle. Med Weter 1984;40(1):33­6 [in Polish]. [11] Richard JL, Debey MC, Chermette R, Pier AC, Hasegawa A, Lund A, et al. Advances in veterinary mycology. J Med Vet Mycol 1994;32(Suppl. 1):169­87. [12] Elad D, Segal E. Immunogenicity in calves of a crude ribosomal fraction of Trichophyton verrucosum: a field trial. Vaccine 1995;13(1): 83­7. [13] Oboˇrilov´a E, Rybnik´aˇr A. Experimental dermatophytosis in calves caused by Trichophyton verrucosum culture. Mycoses 2005;48(3):187­91. [14] Rybnik´aˇr A. Cross-immunity in calves after vaccination against trichophytosis. Acta Vet Brno 1992;61(2):189­94. [15] Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970;227(5259):680­5. [16] Rabilloud T, Carpentier G, Tarronx P. Improvement and simplification of low-background silver staining of proteins by using sodium dithionite. Electrophoresis 1988;9(6):288­91. [17] Sasser M. Identification of bacteria by gas chromatography of cellular fatty acids. MIDI technical note 101. Newark, DE, USA: MIDI; 1990. [18] Sarkisov AC, Petrovich SV, Nikiforov LI, Yablochnick LM. Specific prevention of cattle ringworm. Byul Vses Ord Lenina Inst Eksp Vet 1972;(12):9­14 [in Russian]. [19] Rybnik´aˇr A, Vrzal V, Chumela J, Hejtm´anek M, Weigl E. Vaccination of cattle against trichophytosis using the Czech vaccines. J Mycol M´ed 1996;6(2):93­4. [20] Rybnik´aˇr A, Vrzal V, Chumela J. Protective efficacy of vaccines against dermatophytosis after double and single vaccination. Mycoses 1998;41(1­2):83­6. [21] Rybnik´aˇr A, Vrzal V, Chumela J. Protective efficacy of vaccine against bovine trichophytosis after intramuscular, subcutaneous and intradermal administration. Acta Vet Brno 1997;66(1):57­60. [22] Zharkov II. Periods of formation of immunity to trichophytosis of cattle vaccinated LTF-130. Byul Vses Ord Lenina Inst Eksp Vet 1976;(25):32­3 [in Russian]. [23] Sarkisov AC. Prophylaxie sp´ecifique de la Trichophytose des jeunes bovins. Bull Off Int Epiz 1976;85(3­4):481­8. [24] Siesenop U, Bohm KH, Brandebusemeyer E, Conrad P. Untersuchungen zur Virulenz, Vertraglichkeit und Wirksamkeit der Trichophytie-Lebendvakzine BIOVETA am Rind. Prakt Tierarzt 1994;75(7):605­12. [25] Lund A, Bratberg AM, Solbakk IT. In vitro release of interferongamma by trichophytin-stimulated whole blood cell cultures from ringworm-vaccinated and control calves experimentally inoculated with Trichophyton verrucosum. Vet Dermatol 2001;12(2): 75­80. [26] Estes DM, Closser NM, Allen GK. IFN-gamma stimulates IgG2 production from bovine B cells costimulated with anti-mu and mitogen. Cell Immunol 1994;154(1):287­95. [27] Estes DM, Hirano A, Heussler VT, Dobbelaere DA, Brown WC. Expression and biological activities of bovine interleukin. 4. Effects of recombinant bovine interleukin 4 on T cell proliferation and B cell differentiation and proliferation in vitro. Cell Immunol 1995;163(2):268­79. [28] Tizard IR. Immunity in fetus and newborn. In: Tizard IR, editor. Veterinary immunology. An introduction. 5th ed. W.B. Saunders Company; 1996. p. 237­50. 7954 M. Faldyna et al. / Vaccine 25 (2007) 7948­7954 [29] Howard CJ. Comparison of bovine IgG1, IgG2, and IgM for ability to promote killing of Mycoplasma bovis by alveolar macrophages and neutrophils. Vet Immunol Immunopathol 1984;6(3­4): 321­6. [30] Hejtm´anek M, Koďousek R, Weigl E, Rybnik´aˇr A, Vrzal V, Chumela J. Tissue reaction in guinea pigs after intramuscular application of living vaccine against trichophytosis. Acta Univ Palacki Olomuc, Fac Med 1986;114(2):171­85. Apoptosis and inhibition of gap-junctional intercellular communication induced by LA-12, a novel hydrophobic platinum(IV) complex Lubomír Procházka a , Jaroslav Turánek a,*, Radek Tesařík a , Pavlína Knotigová a , Pavlína Polášková a , Zdeněk Andrysík b , Alois Kozubík b , František Ž ák c , Petr Sova c , Jiri Neuzil d,e , Miroslav Machala a a Veterinary Research Institute, Department of Immunology, Brno, Czech Republic b Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Brno, Czech Republic c PLIVA-Lachema a.s., Research and Development, Brno, Czech Republic d School of Medical Science, Apoptosis Research Group, Griffith University, Southport, Qld., Australia e Molecular Therapy Group, Institute of Molecular Genetics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Prague, Czech Republic Received 20 February 2007, and in revised form 20 March 2007 Abstract A new hydrophobic platinum(IV) complex, LA-12, a very efficient anticancer drug lacking cross-resistance with cisplatin (CDDP), is now being tested in clinical trials. Here we investigated the apoptogenic activity of LA-12 and its effect on gap-junctional intercellular communication (GJIC) in the rat liver epithelial cell line WB-F344. LA-12 induced apoptosis much more efficiently than did CDDP due to a combination of rapid penetration into the cell and attack on DNA, leading to fast activation of p53 and caspase-3. Exposure of WBF344 cells to LA-12 led to rapid induction of the time- and dose-dependent decrease in GJIC. On the molecular level, loss of GJIC induced by LA-12 was mediated by activation of extracellular signal-regulated kinase (ERK)-1 and ERK-2, as demonstrated by the use of inhibitors of ERK activation. Inhibition of GJIC was linked to rapid hyperphosphorylation of connexin-43 and disappearance of connexon clusters from membranes, which was not observed in the case of CDDP. Ó 2007 Elsevier Inc. All rights reserved. Keywords: Cisplatin; LA-12; Gap-junctional intercellular communication; Connexin-43; MEK/ERK pathway; WB-F344 cells Cisplatin (CDDP1 ) and cisplatin-based complexes belong to well established armament in anticancer chemotherapy, which has two major characteristics. Firstly, CDDP is one of the most toxic anticancer drugs and secondly, many tumours exhibit CDDP resistance, either ab initio (e.g., non-small-cell lung and colon cancer) or acquired during therapy (e.g., small-cell lung or ovarian cancer) [1]. Many different analogues of CDDP have been synthesised with the hope of reducing toxic side-effects and overcoming multidrug resistance [1]. PLIVA-Lachema researchers designed and synthesised a new hydrophobic platinum(IV) complex [(OC-6-43)-bis (acetato)(1-adamantylamine)amminedichloroplatinum (IV)], coded as LA-12, which is more toxic to cancer cells than CDDP and efficiently kills CDDP-resistant cancer cells [2­4], as also documented in pre-clinical studies [5,6]. Moreover, it has been shown that LA-12, although being superior in killing cancer cells, does not possess the high 0003-9861/$ - see front matter Ó 2007 Elsevier Inc. All rights reserved. doi:10.1016/j.abb.2007.03.021 * Corresponding author. Fax: +420 5 4121 1229. E-mail address: turanek@vri.cz (J. Turánek). 1 Abbreviations used: CDDP (cisplatin), (SP-4-2)-diamminedichloroplatinum(II); cx43, connexin-43; DBalP, dibenzo[a,l] pyrene; ERK, extracellular signal-regulated kinase; GJIC, gap-junctional intercellular communication; LA-12, (OC-6-43)-bis(acetato)(1-adamantylamine)amminedichloroplatinum(IV); MTT, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-biphenyltetrazolium bromide; PARP, poly(ADP-ribose)polymerase; PMSF, phenylmethylsulphonylfluoride; TPA, phorbol ester (12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate); transplatin, (SP-4-1)-diamminedichloroplatinum(II). www.elsevier.com/locate/yabbi ABBArchives of Biochemistry and Biophysics xxx (2007) xxx­xxx ARTICLE IN PRESS Please cite this article in press as: L. Procházka et al., Arch. Biochem. Biophys. (2007), doi:10.1016/j.abb.2007.03.021 deleterious side-effects associated with application of CDDP, with the maximum tolerated dose in the mouse as high as 1 g/kg [6]. This third-generation platinum(IV)based anticancer drug is in the phase I clinical trial. The role of gap-junctional intercellular communication (GJIC) in cancer biology and drug resistance is now studied to understand the phenomena responsible for the failure of cancer treatment on one hand and association of inhibition of GJIC with carcinogenesis on the other hand [7]. Gap junctions are formed by protein subunits known as connexins and are found in large numbers in most tissues. These channels mediate electrical and chemical coupling between cells. GJIC, together with other communication mechanisms, control cell proliferation, differentiation, apoptosis, and adaptive response to endogenous and exogenous signals. GJIC is required for completion of embryonic development, maintenance of tissue homeostasis, and regulation of normal cell growth [8­10]. Thus far, 20 members of the connexin family have been described, of which connexin-43 (cx43) is a widespread short-lived protein [11,12]. Connexins are regulated by multiple mechanisms, including MAP kinasedependent phosphorylation [13­15] as well as lysosomal and proteasomal degradation [16,17]. We have been interested in the molecular mechanism by which platinum-based anticancer drugs induce cell death. Besides the established mechanisms, evidence shows that CDDP toxicity is also modulated by a MAP kinase pathway, for example contributing to cytochrome c release [18,19], though opposing data have been also reported [20]. In spite of no definitive understanding the mechanism of the link between the functional status of connexins and regulation of apoptosis, there are emerging data suggesting that CDDP can also affect GJIC, possibly by regulating the MAP kinase-dependent phosphorylation of specific sites on cx43, although the data are inconclusive [14,15]. Expression of cx43 and the functional status of GJIC were documented in human ovarian surface epithelial cells and ovarian carcinomas in vivo and in vitro as the major gap-junctional protein [21]. Secondary transfer of molecules, e.g. glutathione, from resistant to sensitive cells may induce the transfer of drug resistance [22]. A contribution of a bystander effect based on connexin to the overall tumour drug resistance is not clear. Albeit, experimental evidence was published that Ca+2 is the most probable cell-killing signal pervading through gap junctions [23,24]. We used the rat liver epithelial cell line WB-F344 expressing cx43 and wild type p53, to study the effect of CDDP and the platinum(IV) complex LA-12 on GJIC inhibition and apoptosis. To our knowledge, this is the first study addressing this topic. Materials and methods Chemicals Cisplatin [CDDP, (SP-4-2)-diamminedichloroplatinum(II)] and a new platinum(IV) complex LA-12, [(OC-6-43)-bis(acetato)(1-adamantylamine)amminedichloroplatinum(IV)], were synthesised by PLIVA-Lachema, Brno, Czech Republic. Chemical structures of both platinum complexes are presented in Fig. 1A. Fluorescent dye Lucifer Yellow and Hoechst 33258, MTT, 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA), dibenzo[a,l] pyrene (DBalP), were purchased from Sigma­Aldrich (Prague, Czech Republic), as were other chemicals unless indicated otherwise. Chemical inhibitors used were: SP600125, GF 109203x (Sigma), U0126 (Calbiochem), SB202190 and AG 1478 (Alexis). LA-12 and cisplatin were mixed with b-cyclodextrin in molar ratio 1:3 and dissolved in DMEM and sonicated. GJIC inhibition assay WB-F344 rat liver epithelial cells, a kind gift from Dr. James E. Trosko [25], were cultured in DMEM supplemented with pyruvate (110 mg/L), 10 mM Hepes, and 10% fetal bovine serum. Confluent cells, grown in 24-well plates, were exposed to CDDP or LA-12. After the exposure, a modified protocol of scrape-loading dye transfer assay (SL/DT) was used to assess GJIC [26]. The cells were washed twice with PBS, the fluorescent dye (Lucifer Yellow, 0.05 w/v in PBS) was added, and the cells were scraped using an adapted chisel-like surgical steel blade. After 4 min, the cells were washed twice with PBS. The migration of the dye from the scrape line was measured using an inverted epifluorescent microscope (T 200, Nikon, Japan). Three independent experiments were carried out in duplicates; at least three scrapes per well were evaluated. The ratio of GJIC inhibition related to the negative control was evaluated and expressed in percentage (fraction of control, %FOC). Morphological changes of the confluent layer of WB-F344 cells were assessed during the exposure to the platinum complexes using a microscope equipped with the Hoffman modulation contrast. Typical apoptotic morphology (blebs and prolapses of cytoplasm, apoptic bodies and shrunken cells) was easily distinguishable in WB-F344 cells treated with toxic doses of the platinum drugs. Cytotoxicity test Cells were grown in DMEM supplemented with pyruvate (110 mg/L), 10 mM Hepes, and 10% fetal bovine serum. Cells were seeded in 96-well flat-bottom microplates at the density 2.5­3 104 per mL, 100 lL per well, and were grown for 16­24 h. The drugs (20 lL) were added to the wells and the cytotoxic effect was evaluated after 24 h of exposure to the drugs at 0.3­80 lM. The MTT assay [27,28] was used to measure cytotoxic effects of the tested drugs on the WB-F344 cells. MTT (Sigma) was dissolved in PBS at the concentration of 5 mg/mL and sterilised by filtration. The MTT solution was added into the wells of 96-well flat-bottom microplates with cells at the dose of 20 lL per well. The plates were incubated at 37 °C and 5% CO2 for 3 h. To enhance the dissolution of the dark-purple crystals of formazan, 110 lL of 10% SDS in PBS (final pH 5.5) were added to all wells. The microtitre plates were stored in a light-tight box at room temperature and evaluated on the next day using the microplate reader iEMS (Labsystem, Turku, Finland) at 540 nm. All experiments were performed in triplicates. Immunostaining of connexin-43 The cells were cultured to confluency on glass coverslips in four-well plates, treated with the tested compound and fixed in methanol/acetone 1:1 for 20 min at 20 °C. Cells were incubated with PBS containing 3% bovine serum albumin and 5% dried non-fat milk and 0.1% Tween for 1 h and subsequently with anti-cx43 antibody (Sigma) and with FITC coupled anti-rabbit IgG [29]. The coverslips were mounted on glass slides with the Vactashield Hard Set mounting medium. Immunofluorescence images were captured using the inverted epifluorescent microscope T 200 equipped with a digital camera (CCD-1300, Nikon, Japan) and the LUCIA software (LIM, Czech Republic). 2 L. Procházka et al. / Archives of Biochemistry and Biophysics xxx (2007) xxx­xxx ARTICLE IN PRESS Please cite this article in press as: L. Procházka et al., Arch. Biochem. Biophys. (2007), doi:10.1016/j.abb.2007.03.021 Western blotting Cells were grown in 6-well plates to the same confluency as for the SL/ DT assay, treated as required, and harvested in 120 lL of the lysis buffer (1 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 1% Triton X-100, 10 mM Tris, 0.1% SDS). The samples were then sonicated, and the protein concentration determined using the bicinchoninic acid method and the iEMS reader. The samples were then diluted with the reducing sample buffer to equal protein levels and boiled for 3 min. Extraction and SDS­PAGE separation of proteins was performed as published earlier [30]. Phosphorylation of cx43 Protein extraction, SDS­PAGE and Western blotting of cx43 were performed according to the described methods [9]. Anti-cx43 polyclonal IgG (Sigma), recognising the C-terminal segment of the cytoplasmic domain corresponding to the amino acid residues 363­382, was used for immunostaining the cx43 protein transferred to a nitrocellulose membrane. Detection was performed using the solution of 0.03% (w/v) diaminebenzidine and 0.1% H2O2 in PBS. Cx43 immunoreactive bands were designated P0 (unphosphorylated connexin), P1, P2, and P3 (phosphorylated connexins) according to the nomenclature recommended by Matesic et al. [29]. The sample extracts from the WB-F344 cells treated with 20 nM TPA were used as a positive control for highly phosphorylated cx43 (P2, P3) to compare the extent of connexin phosphorylation after the treatment of WB-F344 cells with the platinum compounds. Activation of Erk Cells were deprived of serum for 24 h to reduce the background levels of ERK activity. For detection of phosphorylated Erk1 and Erk2, the PVDF membrane was incubated with an anti-phospho-Erk polyclonal IgG in 5% milk for 3 h (New England Biolabs, Beverly, MA, USA). The Erk protein bands were detected using the ECL kit (Amersham Bioscience, UK). p53(ser15), PARP, b-actin Other proteins were detected using the following antibodies: antip53(ser15) IgG (Cell Signalling), anti-PARP IgG (Cell Signalling) and anti-b-actin IgG (Sigma). Detection was performed using the ECL kit as described above. Hoechst staining WB-F344 cells were grown to confluency in a 6-well plate with 2.5 ml media per well and treated as specified, after which 125 lL of 1% Triton 0 0.5 1 A540 B 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h -2 -1 0 21 log c (M) C 0 0.5 1 A540 H2N Pt H3N Cl Cl OCOCH3 OCOCH3 Pt Cl Cl H3N H3N CDDP LA-12 F E DA Fig. 1. Dose­response cytotoxicity curves and time course of morphological changes of WB-F344 monolayer after treatment with CDDP and LA-12. (A) Shows the structure of CDDP and LA-12. WB-F344 cells were seeded and exposed to CDDP (B) or LA-12 (C) as shown and cytotoxicity was assessed using the MTT assay as described in Materials and methods. WB-F344 cells were seeded and left untreated (D) or were exposed to 10 lM LA-12 for 4 h (E) and 7 h (F), and their images were then taken using Hoffmann contrast microscopy. The insets show nuclei of the cells after staining with Hoechst 33258 and visualisation using an epifluorescence microscope. The IC50 values for CDDP were 35.5 lM, 26.9 lM, and 19.9 lM (exposure time 24 h, 48 h, and 72 h respectively). The IC50 values for LA-12 were 10 lM, 2.7 lM, and 0.7 lM (exposure time 24 h, 48 h, and 72 h respectively). L. Procházka et al. / Archives of Biochemistry and Biophysics xxx (2007) xxx­xxx 3 ARTICLE IN PRESS Please cite this article in press as: L. Procházka et al., Arch. Biochem. Biophys. (2007), doi:10.1016/j.abb.2007.03.021 X-100 in PBS was added per well, and the cells were left for 3 min and Hoechst 33258 stain (Sigma) then added at the final concentration of 2 lg/ml. After 3 min, the cells were spun down (200g, 5 min) and observed in an epifluorescence microscope. Statistics Lucifer Yellow diffusion zones were evaluated using the LUCIA imaging analyses software. The ratio of GJIC inhibition related to the negative control was evaluated and expressed in percentage (fraction of control, %FOC). The cytotoxicity curves were constructed and the IC50 values calculated using the GraphPad PRISM software (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA). Results and discussion Previous reports showed that LA-12 was much more toxic to cancer cells than the prototypic drug CDDP (see structures of the drugs in Fig. 1A). Fig. 1B and C shows that this is also the case for the rat liver epithelial cell line WB-F344, revealing higher efficacy of LA-12 by $2 orders of magnitude. Fig. 1D­F shows Hoffmann modulation contrast and fluorescence microscopy of control and LA-12-exposed WB-F344 cells after staining with Hoechst 33258, revealing significant changes in the nuclear morphology of the cells following incubating with LA-12. High cytotoxic potential of LA-12 is also reflected by its strong effect of the exposure time on the IC50 values in comparison to CDDP, and by a very sharp transition from non-toxic to toxic concentrations of LA-12 (Fig. 1B and C). Contrary to other platinum(II) or (IV) complexes (e.g. cisplatin, oxaliplatin, carboplatin, and satraplatin) tested in our laboratory, rapid initiation of apoptosis in cancer cell lines occurred at relatively low levels of LA-12 [2­4]. Treatment of WB-F344 cells with lower concentrations of LA-12 (1 or 10 lM) neither disturbed the cell monolayer nor increased the number of apoptotic cells within 4 h of treatment. Fig. 1D­F shows Hoffmann contrast microscopy pictures of the monolayer of control WB-F344 cells and cells exposed to10 lM LA-12. The monolayer was intact at least for 4 h. After 7 h of exposure the rips surrounded by high number of cells in apoptosis appeared in the monolayer. Morphological signs of apoptosis were well developed. Fluorescence staining with Hoechst 33258 showed significant changes in the nuclear morphology of the cells (see inserts in Fig. 1D­F following incubation with 10 lM LA-12. After a 9 h exposure, the monolayer was completely destroyed and a high number of cells were in various stages of apoptosis (micrograph not shown). Increased number of cells displaying morphological changes specific for early stage of apoptosis and a number of rips in the monolayer were seen after a 3-h exposure of the cells to high concentrations of LA-12 (80 lM). In contrast to LA-12, more than 9 h were needed for high concentrations of CDDP (80 lM) to see the first morphological signs of apoptosis and appearance of the first rips in the cell monolayer (micrograph not shown). Since the nuclear fragmentation of WB-F344 cells exposed to LA-12 as shown in Fig. 1F is reminiscent of apoptotic morphology, we carried out experiments whose aim was to confirm or rule out the apoptotic type of cell death. One general feature of apoptosis is activation of caspases, which then cleave the so-called `death substrate' in a specific manner. One of the caspases activated during apoptosis is caspase-3, which efficiently cleaves PARP into two specific fragments [31]. As shown in Fig. 2A, LA-12 caused PARP fragmentation after 6 h of treatment, suggestive of a typical apoptogenic activity. Since CDDP is known to induce apoptosis by activation of the transcriptional activity of p53 due to formation of adducts with genomic DNA, we studied whether the superior toxicity of LA-12 was due to faster kinetics of p53 activation, as documented by phosphorylation of the protein on Ser15. Fig. 2B reveals that LA-12 caused Ser15 phosphorylation and thereby activation of p53 in WB-F344 cells as soon as within 60 min, while CDDP exerted this effect much later, i.e. 22 h after addition to the cells. The intensity of p53 phosporylation was comparable to that observed with DBalP, which was used as a positive control [32]. These results confirm the apoptotic type of cell death induced by LA-12 and indicate that it occurs with fast kinetics, most likely due to rapid activation of p53. While there has been extensive research into the role of p53 in apoptosis induction by CDDP and similar compounds, little is known about the effect of these agents on 116 kDa 89 kDa h -actin A 0 60 90 120 150 180 210 240 min p-p53(ser15) p-p53(ser15) LA-12 CDDP DBaLP B 0 1284 16 20 h 0 226 84 0 965 874 24 h p-p53(ser15) Fig. 2. LA-12 induces apoptosis and causes p53 phosphorylation. (A) WB-F344 cells were exposed to 10 lM LA-12 for the time periods indicated and inspected using Western blotting for the cleavage of PARP. (B) WB-F344 cells were treated with 10 lM LA-12, 30 lM CDDP or 100 nM DbaLP for the periods shown and assessed for p53 phosphorylation at Ser15 by Western blotting. The middle part of (B) shows p53 phosphorylation in cells exposed to 30 lM CDDP and the bottom part of (B) shows p53 phosphorylation in cells exposed to 10 lM LA-12 in earlier phases of the experiment. DBaLP was used as a positive control. 4 L. Procházka et al. / Archives of Biochemistry and Biophysics xxx (2007) xxx­xxx ARTICLE IN PRESS Please cite this article in press as: L. Procházka et al., Arch. Biochem. Biophys. (2007), doi:10.1016/j.abb.2007.03.021 GJIC, although it has been shown that compounds like CDDP may suppress intercellular communication [14,15]. We therefore studied if LA-12 affects GJIC in an established model, the cell line WB-F344, using the Lucifer Yellow diffusion assay. As documented in Fig. 3, CDDP exerted only a low effect on GJIC at concentrations of up to 80 lM, while LA-12 showed an $40% and almost 100% inhibition at 10 lM at 30 min and 2 h, respectively. Fig. 3C shows the sigmoidal curves for GJIC inhibition by exposure of the cells to LA-12, which allowed to calculate the EC50 values to be 12.3 and 6 lM for the 2- and 3-h exposure, respectively. Transplatin, the non-cytotoxic platinum complex, was used as a negative control. The IC50 value for transplatin was >160 lM, and incubation of the WB-F344 cells with transplatin (80 lM) for 24 h did not induce any morphological changes. Moreover, transplatin did not induce any inhibition of GJIC at the dose of 80 lM (data not shown). These results indicate that the ability of LA-12 to inhibit GJIC may reflect the high apoptogenic activity of LA-12 in contrast to CDDP. The effect of LA-12 on GJIC inhibition is in a good correlation with the cytotoxic data shown in Fig. 1B and C. We have also found a direct correlation between cytotoxicity and inhibition of GJIC in the homologous series of platinum(II) and (IV) based drugs (unpublished results), but LA-12 is unique among them with respect to induction of rapid onset of apoptosis in various cancer cell lines at concentrations relevant to levels found in sera of CDDP-treated patients. Due to the time needed for penetration of LA-12 into the cells, interaction with DNA, formation and recognition of DNA-platinum adducts leading to triggering irreversible pro-apoptotic signals, LA-12 required more than 30 min to induce significant inhibition of gap junctions in the WBF344 cells (Fig. 3B). The GJIC inhibition induced by LA12 was a relatively slow process when compared to the effect of non-genotoxic xenobiotics, e.g. low-molecularweight polycyclic aromatic hydrocarbons, which inhibit GJIC within 15­30 min after exposure, or phorbol esters such as TPA inducing inhibition of GJIC within 5 min. This rapid onset of GJIC inhibition induced by TPA or polyaromatic hydrocarbons is caused by direct interactions with protein kinases and a consequent activation of intracellular signal transduction pathways [29,30]. The assay used for assessment of GJIC inhibition is based on diffusion of the fluorescent dye Lucifer Yellow across rows of WB-F344 cells via connexin channels connecting the cells. Fig. 4 documents this assay and clearly shows that LA-12 suppressed diffusion of the dye relative to the control. TPA, used as a positive control [33], exerted similar inhibition on Lucifer Yellow diffusion, while the inhibitory activity of LA-12 was overcome by the MEK1/ 2 inhibitor U0126 added to cells at 20 lM and 30 min before LA-12. That the MEK pathway, but not several other signalling pathways, may be involved in inhibition of GJIC in the case of LA-12 is documented in Table 1. It indicates that within the inhibitors tested, only the MEK1/2 inhibitor U0126 exerted an effect. Moreover, results in Table 1 suggest that the effect of the MEK1/2 inhibitor may involve phosphorylation of an important component of GJIC, cx43. We then followed the fate of cx43 in WB-F344 cells exposed to LA-12, since an earlier report revealed its ubiquitination and degradation following its hyperphosphorylation [16]. Hyperphosphorylation of cx43 induced by LA-12 or TPA effected also relocalisation of cx43 from the membrane into the cytosol. Immunostaining of connexon clusters showed their rapid disappearance from cell membrane after treatment with TPA or LA-12 (Fig. 6). Relocalisation of cx43 was also prevented by application of the inhibitor U0126. We further investigated a possible link between the effect of LA-12 on components of the MEK pathways, ERK1 and ERK2, and on the phosphorylation status of cx43, since it has been shown that hyperphosphorylation of cx43 via the 0.01 0.1 1 0 50 100 %FOC 2h 3h log c (M) 10-6 M 10-5 M 8x10-5 M 60 120 180 240 Time (min) 0 50 100 %FOC 10-6 M 10-5 M 8x10-5 M 60 120 180 240 Time (min) 0 50 100 %FOC Fig. 3. LA-12 inhibits intercellular communication. WB-F344 cells were exposed to CDDP (A) and LA-12 (B) at concentrations and for times shown and assessed for GJIC by the Lucifer Yellow diffusion method as detailed in Materials and methods. (C) Shows the effect of different concentrations of LA-12 on GJIC following 2- and 3-h exposure. There was no effect of CDDP on inhibition of GJIC, so the graph for CDDP was omitted. The IC50 values are 12 lM for 2 h and 6 lM for 3 h of treatment. L. Procházka et al. / Archives of Biochemistry and Biophysics xxx (2007) xxx­xxx 5 ARTICLE IN PRESS Please cite this article in press as: L. Procházka et al., Arch. Biochem. Biophys. (2007), doi:10.1016/j.abb.2007.03.021 MEK pathway causes GJIC inhibition [16,29]. Fig. 5A shows Western blots documenting that, indeed, LA-12 caused ERK-dependent phosphorylation of cx43. Thus, exposure of WB-F344 cells to LA-12 resulted in phosphorylation of both ERK1 and ERK2 and in hyperphosphorylation of cx43 (appearance of the band designated cx43 P2), which was abrogated by U0126. A very similar pattern was observed in the case of TPA that is known to activate ERK and inhibit GJIC via cx43 hyperphosphorylation. On the other hand, in corresponding experiments, we did not observe any alteration of the phosphorylation status of cx43 in the presence of CDDP, although the drug caused activation of ERK, albeit at a later stage (Fig. 5B). A good correlation of the data presented in Figs. 4 and 5 imply that activation of ERK and subsequent phosporylation of cx43 and its relocalisation form the cell membrane (Fig. 6) is responsible for GJIC inhibition induced by LA-12. Activation of ERK was also found to be important for induction of apoptosis by CDDP in various cell lines [14] and inhibition of the MEK/ERK pathway by U0126 can protect cells against toxic effect of CDDP [15]. We tested a possible role of the ERK pathway activation in WBF344 cells for the toxicity of CDDP and LA-12. We found that application of U0126 decreased apoptosis in WB-F344 cell treated with CDDP (Fig. 7) but no effect was observed for LA-12 (data not shown). Taken together, activation of ERK1/2 by LA-12 is connected to inhibition of GJIC but, in contrast to CDDP, might not be essential for induction of apoptosis. The efficacy of LA-12 to induce apoptosis and inhibit GJIC may be due to its faster accumulation in target cells, including those resistant to CDDP, and due to very fast Fig. 4. LA-12 inhibits GJIC communication through the MEK/ERK pathway. WB-F344 cells were exposed for 3 h to 10 lM LA-12 without (B) and with 30-min pre-incubation with 20 lM U0126 (D). (A) Shows the negative control (b-cyclodextrin exposure) and (C) the positive control (exposure to 20 nM TPA for 30 min). Following treatment, the cells were stained with Lucifer Yellow as detailed in Materials and methods and visualised by epifluorescence microscopy using a 100-fold magnification. Fig. 5. LA-12 causes hyperphosphorylation of cx43 via ERK activation. WB-F344 cells were exposed to 10 lM LA-12 for 2 h (A) or 30 lM CDDP for 12 h (B) in the absence or presence of 20 lM U0126. Exposure to 20 nM TPA was used as a positive control. Following treatment, the cells were probed by Western blotting for phosphorylated cx43, and for total and phosphorylated ERK1/2, as detailed in Materials and methods. Table 1 Delineation of pathways affected by LA-12 Pathway Treatment GJIC status Cx43 phosphorylation status MEK U0126 + LA-12 Functional Basal U0126 + TPA Functional Basal PKC GF109203x + LA-12 Inhibited Hyperphosphorylated GF109203x + TPA Functional Basal EGFR AG1478 + LA-12 Inhibited Hyperphosphorylated AG1478 + TPA Inhibited Hyperphosphorylated p38 SB202190 + LA-12 Inhibited Hyperphosphorylated SB202190 + TPA Inhibited Hyperphosphorylated JNK SP600125 + LA-12 Inhibited Hyperphosphorylated SP600125 + TPA Inhibited Hyperphosphorylated WB-F344 cells were exposed to 10 lM LA-12 for 2 h and to 10 nM TPA for 30 min following 30-min pre-incubation with 20 lM U0126, 10 lM GF109203x, 10 lM AG1478, 10 lM SB202190 or 200 nM SP600125, and the cx43 phosphorylation status was evaluated as detailed in Materials and methods. The GJIC status has been assigned as functional or inhibited under the conditions of the experiment as indicated by the Lucipher Yellow method (see Materials and methods). 6 L. Procházka et al. / Archives of Biochemistry and Biophysics xxx (2007) xxx­xxx ARTICLE IN PRESS Please cite this article in press as: L. Procházka et al., Arch. Biochem. Biophys. (2007), doi:10.1016/j.abb.2007.03.021 formation of adducts with DNA bases (unpublished results). Rapid connection between the DNA injury signal and pro-apoptotic pathways is probably responsible for the strong in vitro cytotoxic effects of LA-12. Hyperphosphorylation of cx43 via activation of the MEK/ERK pathway results in disappearance of connexons and inhibition of GJIC in WB-F344 cells treated with toxic doses of LA12. On the other hand, treatment of cells with non-toxic doses of LA-12 (61 lM) did not cause any inhibition of GJIC. These data indicate that disturbance of tissue homeostasis due to inhibition of GJIC may be linked to direct cytotoxic effects of platinum drugs, rather than to an indirect effect found for some carcinogens, such as TPA or polyaromatic tumour promoters. The possible role of the rapid inhibition of GJIC as a feed-back signal magnifying apoptotic pathway is a topic for future research in the intriguing field of cell proliferation and apoptosis. Acknowledgments This work was supported by a grant of the Ministry of Industry and Trade of the Czech Republic, Contract No. PZ-Z2/29, ``New Medicines for Cancer Therapy'', and a grant the Ministry of Agriculture of the Czech Republic (Grant No. MZE 0002716201) and IGA Acad. Sci. Czech Republic (No. 1QS500040507). References [1] L.R. Kelland, in: B. Lippert (Ed.), Chemistry and Biochemistry of a Leading Anticancer Drug, Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 1999, pp. 497­521. [2] F. Ž ák, J. Turánek, A. Kroutil, P. Sova, A. Mistr, A. Poulová, P. Mikolin, Z. Ž ák, A. Kašná, D. Záluská, J. Neča, L. Šindlerová, A. Kozubík, J. Med. Chem. 47 (2004) 761­763. [3] J. Turánek, A. Kašná, D. Záluská, J. Neča, V. Kvardová, P. Kn}otigová, V. Horváth, L. Šindlerová, A. Kozubík, P. Sova, A. Kroutil, F. Ž ák, A. Mistr, Anticancer Drugs 15 (2004) 537­543. [4] A. Kozubík, V. Horváth, L. Švihalková-Šindlerová, K. Souček, J. Hofmanová, P. Sova, A. Kroutil, F. Ž ák, A. Mistr, J. Turánek, Biochem. Pharmacol. 69 (2005) 373­383. [5] P. Sova, A. Mistr, A. Kroutil, F. Zak, P. Pouckova, M. Zadinova, Anticancer Drugs 17 (2006) 201­206. [6] P. Sova, A. Mistr, A. Kroutil, F. Zak, P. Pouckova, M. Zadinova, Anticancer Drugs 16 (2005) 653­657. [7] J.E. Trosko, C.C. Chang, Mutat. Res. 480­481 (2001) 219­229. [8] J.E. Trosko, C.C. Gang, B. Upham, M. Wilson, Toxicol. Lett. 102­ 103 (1998) 71­78. [9] J.E. Trosko, C.C. Chang, M.R. Wilson, B. Upham, T. Hayashi, M. Wade, Methods 20 (2000) 245­264. [10] D.W. Laird, J.S. Saez, in: E.L. Hertzberg (Ed.), Advances in Molecular and Cell Biology, Vol. 30, Elsevier B.V., 2000, pp. 99­128. [11] G. Sohl, K. Willecke, Cardiovasc. Res. 62 (2004) 228­232. [12] D.W. Laird, Biochem. J. 394 (2006) 527­543. [13] P.D. Lampe, A.F. Lau, Int. J. Biochem. Cell. Biol. 36 (2004) 1171­ 1186. [14] X. Wang, J.L. Martindale, N.J. Holbrook, J. Biol. Chem. 275 (2000) 39435­39443. [15] S.K. Jo, W.Y. Cho, S.A. Sung, H.K. Kim, N.H. Won, Kidney Int. 67 (2005) 458­466. [16] H. Qin, Q. Shao, S.A. Igdoura, M.A. Alaoui-Jamali, D.W. Laird, J. Biol. Chem. 278 (2003) 30005­30014. [17] E. Leithe, E. Rivedal, J. Biol. Chem. 279 (2004) 50089­50096. [18] M.S. Park, M. De Leon, P. Devarjan, J. Am. Soc. Nephrol. 13 (2002) 858­865. [19] W. Woesmann, X. Chen, A. Borkhardt, Cancer Chemother. Pharmacol. 50 (2002) 397­404. Fig. 6. LA-12 causes internalisation of cx43. WB-F344 cells were allowed to reach confluence, after which they were treated with the vehicle (control cells, A), 10 nM TPA for 30 min (B) and 10 lM LA-12 for 2 h alone (C) or following a 30-min pre-incubation with 20 lM U0126 (D). The cells were then fixed and immunostained for cx43. The images were acquired using epifluorescence microscopy. A B -2 -1 0 1 32 0 0.25 0.50 0.75 log c (M) CDDP A540 CDDP+U0126 CDDP C Fig. 7. Inhibitory effect of U0126 on apoptosis induced by CDDP in WBF344 cells. Micrographs show WB-F344 cells treated with 40 lM CDDP for 48 h (A) or 40 lM CDDP + 20 lM U0126 (B). Pictures were obtained using Hoffman modulation contrast microscopy. (C) Shows cytotoxicity curves for WB-F344 cells treated with CDDP for 48 h with or without pretreatment with 20 lM U0126. The IC50 values are 27 lM for CDDP and 47 lM for the cells pre-treated with U0126. L. Procházka et al. / Archives of Biochemistry and Biophysics xxx (2007) xxx­xxx 7 ARTICLE IN PRESS Please cite this article in press as: L. Procházka et al., Arch. Biochem. Biophys. (2007), doi:10.1016/j.abb.2007.03.021 [20] A. Mandic, K. Viktorsson, T. Heiden, J. Hansson, M.C. Shoshan, Melanoma Res. 11 (2001) 11­19. [21] E.A. Hanna, S. Umhauer, S.L. Roshong, M.P. Piechocki, M.J. Fernstrom, J.D. Fanning, R.J. Ruch, Carcinogenesis 20 (1999) 1369­ 1373. [22] O.S. Frankfurt, D. Seckinger, E.V. Sugarbaker, Cancer Res. 51 (1991) 1190­1195. [23] V.A. Krutovskikch, C. Piccoli, H. Yamasaki, Oncogene 21 (2002) 1989­1999. [24] R. Jensen, P.M. Glazer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 6134­ 6139. [25] M. Tsao, J.D. Smith, K.G. Nelson, J.W. Grisham, Exp. Cell Res. 154 (1984) 38­52. [26] M.H. El-Fouly, J.E. Trosko, C.C. Chang, Exp. Cell Res. 168 (1987) 422­430. [27] T. Mosmann, J. Immunol. Methods 65 (1983) 55­63. [28] U. Bank, D. Reinhold, S. Ansorge, Allerg. Immunol. 37 (1991) 119­ 123. [29] D.F. Matesic, H.L. Rupp, W.J. Bonney, R.J. Ruch, J.E. Trosko, Mol. Carcinog. 10 (1994) 226­236. [30] A.M. Rummel, J.E. Trosko, M.R. Wilson, B. Upham, Toxicol. Sci. 49 (1999) 232­240. [31] M. Los, M. Mozoluk, D. Ferrari, A. Stepczynska, C. Stroh, A. Renz, Z. Herceg, Z. Wang, K. Schulze-Osthoff, Mol. Biol. Cell 13 (2002) 978­988. [32] Z. Andrysik, M. Machala, K. Chramostova, J. Hofmanova, A. Kozubik, J. Vondracek, Toxicol. Appl. Pharmacol. 211 (2006) 198­ 208. [33] E. Leithe, V. Cruciani, T. Sanner, S.O. Mikalsen, E. Rivedal, Carcinogenesis 24 (2003) 1239­1245. 8 L. Procházka et al. / Archives of Biochemistry and Biophysics xxx (2007) xxx­xxx ARTICLE IN PRESS Please cite this article in press as: L. Procházka et al., Arch. Biochem. Biophys. (2007), doi:10.1016/j.abb.2007.03.021